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腫瘤原代細胞鑒定技術(shù)
一、形態(tài)學鑒定
1. 在倒置顯微鏡中直接觀察活細胞的形態(tài)學特征
2. 細胞染色檢查 ：
a) 將無菌玻片置于細胞培養(yǎng)皿中，加細胞懸液后培養(yǎng)；
b) 待細胞長滿玻片后取出，用PBS清洗，之后放于載玻片上，待其自然干燥；
c) 用PBS/甲醇（1:1）固定15分鐘；
d) 棄固定液，加合適的染色液染色；
e) 染色完畢后用清水洗凈，置于空氣中干燥，
f) 干燥后，用二甲苯透明，光學樹脂封片后觀察。
二、免疫組織細胞化學鑒定
1. 將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片；
2. PBS清洗標本3次，各1 分鐘；
3. 4%多聚甲醛固定15分鐘；
4. 置于空氣中干燥；
5. PBS清洗標本3次，各2 分鐘；
6. 0.5%Triton X-100孵育 1次20分鐘；
7. PBS清洗標本 3次 各2分鐘；
8. 3%H2O2孵育 15分鐘；
9. DPBS清洗標本 3次 各2 分鐘；
10. 封閉血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液20分鐘；
11. 一抗孵育，4℃ 過夜或37℃ 60 分鐘；
12. PBS清洗標本3次 各5 分鐘；
13. 二抗工作液孵育（濕盒）37℃ 30 分鐘；
14. PBS清洗標本3次 各5 分鐘；
15. C液（濕盒） 37℃ 30 分鐘；
16. PBS清洗標本3次，各5 分鐘；
17. 用顯色液進行顯色；
18. 蒸餾水洗滌2次1 分鐘；
19. 蘇木素復染1分鐘；
20. 清水洗滌30分鐘；
21. 光學樹脂封片后觀察。