大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）分離自骨髓；骨髓是機體的造血組織，位于身體的許多骨骼內(nèi)。成年動物的骨髓分兩種：紅骨髓和黃骨髓。紅骨髓能制造紅細胞、血小板和各種白細胞。血小板有止血作用，白細胞能殺滅與抑制各種病原體，包括細菌、病毒等；某些淋巴細胞能制造抗體。因此，骨髓不但是造血器官，它還是重要的免疫器官。骨髓是存在于長骨（如肱骨、股骨）的骨髓腔和扁平骨（如髂骨）的稀松骨質(zhì)間的網(wǎng)眼中，是一種海綿狀的組織，能產(chǎn)生血細胞的骨髓略呈紅色，稱為紅骨髓。出生時，紅骨髓充滿全身骨髓腔，隨著年齡增大，脂肪細胞增多，相當部分紅骨髓被黃骨髓取代，最后幾乎只有扁平骨骨髓腔中有紅骨髓。骨髓基質(zhì)系統(tǒng)內(nèi)存在的骨髓間充質(zhì)干細胞是一種除造血干細胞以外的、具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，可以向骨、軟骨、肌組織、皮膚、脂肪、神經(jīng)等多種組織分化，因此可以作為組織工程中的種子細胞。在骨髓中，BMSC占骨髓有核細胞總數(shù)的0.001%-0.1%，含量極低。骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)條件要求較高，在培養(yǎng)過程中，受貼壁時間、種植密度、血清含量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH值等條件的影響。
一、實驗原理
活細胞在超低溫下克服了分子間的熱運動，因而可長期保存而不影響活力。在不加任何物質(zhì)條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加人保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞。儲存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
二、實驗材料
①器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機、-70 ℃低溫冰箱、超凈工作臺等。
②試劑：0.25%胰酶、培養(yǎng)基、凍存液（血清:DMSO=9:1）。
三、操作步驟
①選擇處于對數(shù)生長期的細胞，在凍存前24 h內(nèi)換液。
②用0.25%胰蛋白酶消化細胞，倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。加人與消化液等體積的新鮮培養(yǎng)液。將細胞懸液收集至離心管中。
③1000 r/min離心5 min，棄掉含胰蛋白酶的上清液。
④加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5×106~1×107個/mL。
⑤將懸液分至凍存管中，每管1mL。
⑥將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現(xiàn)爆裂。
⑦貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。
⑧將裝有細胞的凍存管在4℃下存放30 min，轉(zhuǎn)放-20 ℃冰箱4 h，然后放入-70 ℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氨容器內(nèi)(-196 ℃)。
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