原代細胞培養(yǎng)純化是細胞生物學研究中的關鍵步驟，旨在從組織中分離并獲得高純度的特定細胞類型，為后續(xù)實驗提供可靠的材料。原代細胞培養(yǎng)純化的作用原理主要圍繞抑制非目標細胞生長、促進目標細胞選擇性增殖。
原代細胞培養(yǎng)純化需結合實驗目的和細胞類型選擇合適的方法。操作過程中需嚴格無菌、優(yōu)化消化條件、檢測細胞活性，并監(jiān)控污染。通過綜合運用多種方法，可獲得高純度、高活性的原代細胞，為后續(xù)實驗提供可靠材料。
我們在介紹原代細胞純化前需要了解原代培養(yǎng)的概念，因為很多小伙伴很容易分不清原代培養(yǎng)與原代細胞的概念：
原代培養(yǎng)（primary culture），通俗地講，就是第一次培養(yǎng)。它是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。
原代培養(yǎng)的實質是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物一經接種到培養(yǎng)皿中就不再分割，任其生長繁殖而不更換培養(yǎng)器皿；
原代培養(yǎng)中的『代』并不是指細胞的『代』數；
原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)基；
植塊培養(yǎng)不一定都是原代培養(yǎng)，植塊培養(yǎng)有時候在培養(yǎng)物增長到一定程度后，也需要移植培養(yǎng)物到新的器皿再培養(yǎng)。
原代細胞（primary culture cell）是指從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞。有人把培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內的細胞統(tǒng)稱為原代細胞。
原代細胞培養(yǎng)純化的主要方法：
機械分離法
◆原理：利用物理方法（如切割、刮除）分離目標細胞。
◆應用：適用于組織塊較大、細胞分布不均的情況，如從器官中分離特定區(qū)域細胞；適用于多種類型細胞明顯成片區(qū)生長，區(qū)域細胞純度較高。
◆操作：在顯微鏡下手動分離目標組織區(qū)域，避免混入其他細胞類型；在顯微鏡下觀察，用記號筆在細胞培養(yǎng)瓶上勾畫出雜細胞的分布區(qū)域，然后用細胞刮刀伸入瓶內，刮除雜細胞，保留目標細胞（常用于成纖維細胞和上皮細胞交錯成塊分布）。
√ 優(yōu)點：操作簡單，成本低。
× 缺點：對細胞機械損傷較大，分離效果可能不如酶消化法。
酶消化法
◆原理：使用胰蛋白酶、膠原酶等酶類消化組織，如膠原酶，特異性降解纖維化組織的膠原蛋白、消化腫瘤組織塊，破壞來自間質的成纖維細胞，可獲得較純的癌細胞；中性蛋白酶，切割細胞外基質中的纖連蛋白和層粘連蛋白，釋放單細胞。
◆應用：廣泛用于貼壁細胞（如成纖維細胞、上皮細胞），適用于纖維化組織（如胰腺、肝臟）、腫瘤組織、上皮細胞和內皮細胞的分離。
◆操作：將組織剪碎后，加入適量酶液消化，通過控制消化時間和溫度，使目標細胞脫離組織，
同時避免消化過度。
√ 優(yōu)點：分離效率高，細胞活性好。
× 缺點：酶的成本較高，消化時間及效果難以控制，且可能對某些細胞類型有毒性。
差速貼壁分離法
◆原理：利用不同種類細胞貼壁速度差異性及細胞敏感性不同，通過控制培養(yǎng)時間差或消化時間差，可選擇性移除未貼壁或弱貼壁的細胞，從而分離目標細胞。
◆應用：成纖維細胞對胰蛋白酶作用敏感，組織塊或消化傳代時，成纖維細胞常常先脫落；原代細胞懸液接種后，成纖維細胞貼壁速度比上皮細胞、心肌細胞快。
◆操作：將剛從組織分散的細胞懸液接種于培養(yǎng)皿內，于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，0.5-2h后，吸取未貼壁細胞懸液，一般先貼壁細胞為成纖維類細胞，未貼壁懸液多為上皮類細胞。
√ 優(yōu)點：無需特殊試劑，操作簡單。
× 缺點：分離周期長，純度可能有限。
化學試劑抑制法
◆原理：利用增殖期細胞的作用敏感性，通過抑制雜細胞增殖，從而避免少量雜細胞成為優(yōu)勢細胞，拉大目的細胞與雜細胞優(yōu)劣勢差而分離目標細胞。
有些化學物質對成纖維細胞的生長有抑制作用，而對培養(yǎng)的目標細胞無明顯影響。因此，在細胞貼壁生長或分裂后，利用這些化學物質抑制成纖維細胞生長，從而獲得純度較高的目標細胞。
如阿糖胞苷通過抑制細胞DNA的合成，干擾細胞的增殖；嘌呤霉素作為蛋白合成抑制劑，能抑制細胞的生長。
◆應用：阿糖胞苷在神經元、心肌等不增殖細胞；嘌呤霉素在微血管內皮細胞等貼壁增殖緩慢的細胞純化作用。
◆操作：將剛從組織分離出來的神經元細胞懸液接種于培養(yǎng)皿內，同時加入合適濃度的藥物篩選，于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，藥物作用2-5d后更換新鮮培養(yǎng)基。
√ 優(yōu)點：操作簡便，成本較低，特定細胞類型效果明顯，可與其他方法聯(lián)合使用。
× 缺點：細胞損傷風險較高，純化效果有限，過程不可控，批次差異大，結果不穩(wěn)定，可能影響細胞功能。
密度梯度離心法
◆原理：利用不同細胞類型的密度差異，通過離心分層。
◆應用：適用于血液細胞等單細胞懸液（如淋巴細胞、單核細胞）的分離。
◆操作：將細胞懸液疊加于密度梯度介質（如Ficoll）上，離心后不同細胞層分布在不同介質層中，收集目標細胞層。
√ 優(yōu)點：分離純度高，適用范圍廣。
× 缺點：離心時間長，對操作技能要求較高。
免疫磁珠分選法
◆原理：利用特異性抗體標記目標細胞，通過磁場分離。
◆應用：高純度分離特定細胞亞群（如CD4+ T細胞、干細胞）。
◆操作：將細胞與磁珠標記的抗體孵育，通過磁場分離標記細胞，未標記細胞被去除。
√ 優(yōu)點：分離純度高，可達99%以上。
× 缺點：設備昂貴，操作復雜，成本較高。
流式細胞術分選法
◆原理：利用熒光標記抗體，通過流式細胞儀識別并分離目標細胞。
◆應用：高精度、高純度分離細胞亞群（如腫瘤干細胞、免疫細胞）。
◆操作：將細胞與熒光標記抗體孵育，通過流式細胞儀分析并分選目標細胞。
√ 優(yōu)點：分離效率高，細胞活性好、純度高，分析參數多、數據全面。
× 缺點：儀器價格昂貴，操作技術門檻高，細胞容易損傷。
專用培養(yǎng)基及相關因子組合篩選法
◆原理：原代細胞的培養(yǎng)成功高度依賴于專用培養(yǎng)基和關鍵生長因子的優(yōu)化組合；不同細胞類型對營養(yǎng)成分（如葡萄糖、氨基酸）、激素（如胰島素）、細胞因子（如EGF、bFGF）的需求各異；因此需要系統(tǒng)篩選和優(yōu)化培養(yǎng)體系來模擬目的細胞體內微環(huán)境（如膠原蛋白、層粘連蛋白），促進細胞貼附、增殖或分化。
信號通路調控生長因子：通過激活特定通路（如EGF→EGFR→MAPK）促進增殖或分化；劑量依賴性：低濃度可能無效，高濃度可能誘導異常分化（如TGF-β在腫瘤中的作用）
◆應用：廣泛用于原代細胞篩選。如神經元細胞：添加B27維持神經特性；干細胞：添加bFGF維持干性；腫瘤細胞：提供高糖和谷氨酰胺支持瓦氏效應（Warburg effect）；血管內皮細胞：需要包被培養(yǎng)皿，促進細胞貼附、增殖，添加VEGF促進血管分化。
◆操作：依據細胞增殖分化特性及信號通路需求，選擇合適基礎培養(yǎng)基，添加相關生長因子，定制專用完*培養(yǎng)基。
√ 優(yōu)點：提高細胞存活率，減少批次變異，適用于臨床級細胞實驗，精準控制細胞代謝行為。
× 缺點：研發(fā)配制價格昂貴，測試驗證周期長，因子添加劑價格昂貴。
在實際操作中，剛分離出的原代細胞往往純度較低，且雜細胞種類多；后期接種培養(yǎng)時，需要根據目的細胞及雜細胞的特性和實時狀態(tài)，運用多種純化方法結合去培養(yǎng)純化，才能達到高純度、高活性的目的原代細胞。
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