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質粒提取科研實驗技術服務介紹
閱讀：229 發(fā)布時間：2024-9-20質粒提取
應用簡介
質粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。質粒是進行分子生物學實驗操作，進行遺傳工程改良物種等工作時最主要的DNA載體。
技術原理
質粒DNA提取方法有3種：堿裂解法、煮沸法和去污劑(如Triton和SDS)裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用于較小的質粒(<15kb)。去污劑裂解法則比較溫和，一般用于分離大質粒(>15kb)。堿裂解法是一種應用為廣泛的制備質粒DNA的方法，其原理為：染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質粒DNA在回到中性時即恢復其天然構象；變性染色體DNA的片段與變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，離心去除沉淀后，就可從上清中回收質粒DNA。目前，市面上質粒提取試劑盒大多數(shù)都是采取上述的堿裂解方法，不同之處在于純化方式。目前比較常用的純化系統(tǒng)是硅基質吸附材料，其原理為在高鹽環(huán)境下質粒DNA能夠結合到硅基質上，然后用低鹽緩沖液或水將質粒DNA從硅基質上洗脫下來。得到的質?？梢杂糜诿盖小CR、測序、細菌轉化、轉染等分子生物學實驗。
實驗方法
1、時間控制問題
裂解時間太長，加入溶液P2后裂解時間不應超過5分鐘；吸附時間不夠；溶解時間不夠都會導致質粒DNA提取實驗失敗。
2、質?？截悢?shù)低
由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質粒DNA提取量低，可更換具體相同功能的高拷貝數(shù)載體。
3、溶液使用不當
溶液P2、P3在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，應置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。
4、吸附柱過載
不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或者×YT菌液體積必須減少；若質?；蛩拗骶欠浅８叩目截悢?shù)或生長率，則需調整LB培養(yǎng)液體積。
5、質粒未全部溶解
洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。
6、乙醇殘留
漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗后應晾干樹脂，再加入洗脫緩沖液。
7、洗脫液加入位置不正確
洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會wan全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。
8、洗脫液不合適
DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫。洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH7.0～8.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內，如果pH過低可能性導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加暖至60℃后使用有利于提高洗脫效率。