99超碰中文字幕在线观看-天天干天天日天天舔婷婷-我看操逼的好看的女人的-日本一二三四五区日韩精品

技術原理
       慢病毒包裝：使用3質粒慢病毒包裝系統(tǒng)，慢病毒系統(tǒng)使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，過表達慢病毒系統(tǒng)使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質粒系統(tǒng)，將質?；靹蚝笫褂昧姿徕}轉染方法轉染至HEK293T細胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。純化后留取部分檢測病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。
       滴度檢測：將病毒顆粒使用梯度稀釋，分別感染293T細胞，感染72h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況。根據(jù)細胞熒光量計算病毒滴度。
       細胞感染：在病毒感染前一天對細胞進行計數(shù)，接種約10000個細胞于12孔板中，培養(yǎng)過夜后使用無血清培養(yǎng)基稀釋病毒，加入12孔板中對細胞進行感染，病毒數(shù)量根據(jù)推薦細胞的感染MOI加入（若無推薦MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,1005個梯度對細胞感染），感染6h后去除含病毒溶液，加入wam全培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度。同時加入puromycin對細胞篩選，篩選約2周時間。細胞篩選好后，使用定量PCR和Westernblot檢測目的基因的穩(wěn)定表達情況。
實驗方法

技術總結：
       1、MOI（multiplicityofinfectin），感染復數(shù)，含義為感染時病毒和細胞數(shù)量的比值。多數(shù)細胞查閱文獻也能獲得推薦的MOI，但不同實驗室，不同病毒測算出的MOI也有差別。所以建議根據(jù)自己包裝的慢病毒重新檢測MOI。
       2、為了能獲得最佳效果的單克隆穩(wěn)定細胞株，可以增大篩選的總量。