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本文來源于微信公眾：生化尋蹤      作者：生化尋蹤

過去十幾年中，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的所有ADC都是由不同數(shù)量的藥物附著在單克隆抗體不同位置的ADC混合而成的。目前業(yè)界已經(jīng)開發(fā)了一系列新的偶聯(lián)策略，旨在控制有效載荷的鏈接位置和數(shù)量，同時(shí)保持結(jié)構(gòu)完整性和同質(zhì)性。

    目前，偶聯(lián)技術(shù)可分為2類：①利用抗體序列中天然的具備反應(yīng)活性的氨基酸殘基來介導(dǎo)的偶聯(lián)技術(shù)，包括抗體表面賴氨酸的側(cè)鏈氨基和鏈間二硫鍵還原后的巰基；②利用基因工程技術(shù)、化學(xué)修飾或酶修飾等在抗體特定位點(diǎn)引入可供反應(yīng)的基團(tuán)，再偶聯(lián)載荷毒素，實(shí)現(xiàn)特定位點(diǎn)偶聯(lián)，此類偶聯(lián)包括工程化半胱氨酸定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)、非天然氨基酸定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)、 酶介導(dǎo)的定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)、糖鏈介導(dǎo)的定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)等。

第一代抗體偶聯(lián)技術(shù)（隨機(jī)偶聯(lián)）

    傳統(tǒng)的 ADC 利用抗體賴氨酸的氨基或打開鏈間二硫鍵獲得的半胱氨酸的巰基進(jìn)行偶聯(lián)。一個(gè)抗體分子包含了 80 ~ 90 個(gè)賴氨酸，偶聯(lián)可能會(huì)發(fā)生在將近 40 個(gè)不同賴氨酸殘基上，打開鏈間二硫鍵會(huì)得到多個(gè)半胱氨酸殘基，同時(shí)破壞了抗體分子的完整性，因此傳統(tǒng)的 ADC 是高度異質(zhì)混合物，其均一性差，穩(wěn)定性低，影響藥效及治療窗。

第二代抗體偶聯(lián)技術(shù)

    通過引入生物正交分子到抗體中，然后利用引進(jìn)的特殊位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)，但是這些特殊位點(diǎn)的引進(jìn)往往需要對(duì)抗體進(jìn)行改造，這可能會(huì)改變抗體的部分性質(zhì)，甚至?xí)淖兛贵w的折疊或者穩(wěn)定性。

1. 引入反應(yīng)性半胱氨酸（THIOMAB技術(shù)）

Genentech最早利用了一種名為THIOMAB的定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)，通過基因工程在抗體的特定點(diǎn)插入半胱氨酸殘基，在還原性條件下，引入的半胱氨酸及鏈間的二硫鍵被還原，在CuSO4的作用下氧化并再次形成二硫鍵，形成位點(diǎn)專一的抗體偶聯(lián)藥物。

    Thiomab 技術(shù)，工程化引入半胱氨酸，既不會(huì)干擾免疫球蛋白的折疊和組裝，也不會(huì)改變抗體抗原的結(jié)合模式，獲得的ADC藥物既保留了其體內(nèi)抗腫瘤活性，還提高了耐受性、降低了系統(tǒng)毒性。該技術(shù)具有高均一性、較好的反應(yīng)活性和穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是需要基因修飾，通常DAR 2。 

    基于此，Seattle Genetics 和 Spirogen 開發(fā)了一種類似的技術(shù)，稱為 MAIA，通過在 mAb 關(guān)鍵區(qū)域的 239 位引入絲氨酸-半胱氨酸突變，用于其 PBD 二聚體的生物綴合。

2. 引入非天然氨基酸

    通過在抗體的原始序列中人工加入非天然氨基酸，使其在抗體表面呈現(xiàn)出可方便偶聯(lián)的特異性位點(diǎn)，從而獲得位點(diǎn)確定、DAR值均一的ADC。該偶聯(lián)技術(shù)du特之處在于可以隨意突變非天然氨基酸，并且得到任意DAR值的ADC，缺點(diǎn)是需要基因修飾、抗體表達(dá)量低、非天然氨基酸序列引起免疫原性和非天然氨基酸的疏水性引起聚集。

    引入的非天然氨基酸通常為乙酰苯丙氨酸、疊氮基甲基-L-苯基丙氨酸和疊氮賴氨酸。非天然氨基酸上帶有的酮基、疊氮基官能團(tuán)可與藥物連接子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，獲得 DAR 均一的 ADC。

3. 酶法偶聯(lián)

    抗體和小分子藥物可以利用酶法實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)。酶法偶聯(lián)具備定點(diǎn)偶聯(lián)的優(yōu)勢，但也存在引入額外序列而造成免疫原性的潛在弊端。因此，在產(chǎn)品開發(fā)過程中，需要對(duì)生成的 ADC 進(jìn)行完善的免疫原性評(píng)估以確保其安全性。

第三代抗體偶聯(lián)技術(shù)

    第二代抗體偶聯(lián)技術(shù)雖然可以實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)，但是需要對(duì)抗體進(jìn)行特殊改造，這在一定程度上可能會(huì)給ADC藥物的開發(fā)帶來一些新的挑戰(zhàn)，因此有研究者開始考慮在不改變抗體完整的基礎(chǔ)上，對(duì)天然的抗體進(jìn)行位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。第三代偶聯(lián)技術(shù)主要是聚焦于選擇du特的氨基酸位點(diǎn)并利用du特的分子或者通過鄰近效應(yīng)進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)，其主要分為以下4種：1）鏈間二硫鍵改造；2）糖基修飾；3）化學(xué)選擇性的修飾；4）基于鄰近效應(yīng)的修飾。

1. 二硫鍵重橋

二硫鍵重橋，又名 Disulfide re-bridging，是利用半胱氨酸選擇性交聯(lián)試劑（如TECP或DTT），將IgG1抗體中4個(gè)鏈間二硫鍵還原，隨后使用雙反應(yīng)試劑在多肽鏈重新連接的同時(shí)，完成小分子有效載荷的安裝或抗體的進(jìn)一步修飾。通過共價(jià)重新連接半胱氨酸殘基，既維持了二硫鍵的穩(wěn)定作用，同時(shí)實(shí)現(xiàn)每個(gè)二硫鍵鏈接一個(gè)有效載荷的受控偶聯(lián)。

該偶聯(lián)方式具有高均一性、不影響抗體的空間結(jié)構(gòu)、通用的氨基酸序列與糖基化修飾等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是鏈內(nèi)錯(cuò)誤橋接，通常DAR 4。

     根據(jù)偶聯(lián)試劑的不同分類分為4類：單/雙砜類試劑； 3,4-二取代馬來酰亞胺；二溴噠嗪二酮和; 二乙烯基嘧啶。

2. 糖基偶聯(lián)

    IgG型抗體中存在兩個(gè)保守的糖基化位點(diǎn)N297，該位點(diǎn)位于CH2結(jié)構(gòu)域，遠(yuǎn)離抗體結(jié)合抗原的功能結(jié)構(gòu)域，因此利用該位點(diǎn)進(jìn)行偶聯(lián)不會(huì)對(duì)抗體的結(jié)合功能造成影響。

    ADC的糖基化偶聯(lián)技術(shù)不改變抗體的結(jié)構(gòu)，無需進(jìn)行抗體工程化改造、不引入非天然氨基酸和特定的氨基酸序列突變以便進(jìn)行偶聯(lián)。目前可用Fc端糖基化偶聯(lián)技術(shù)有：糖基氧化的修飾、糖代謝工程、酶工程等?？偟膩碚f，利用該糖位點(diǎn)的偶聯(lián)，主要是通過在糖基上引入一個(gè)新的反應(yīng)基團(tuán)，然后再利用相關(guān)試劑進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)。

2.1 基于糖基的氧化的修飾

    Fc端糖基的核心可以通過選擇性高碘酸鹽氧化修飾，然后與酰肼毒素小分子反應(yīng)，形成具有完整免疫反應(yīng)性的腙連接綴合物。這個(gè)技術(shù)早在gemtuzumab ozogamicin開發(fā)的時(shí)候就曾使用過，但抗體的敏感性導(dǎo)致了在氧化過程中抗體活性的損失，所以才采用的AcBut連接子的賴氨酸隨機(jī)偶聯(lián)技術(shù)。

2.2 代謝工程化修飾抗體寡糖

    通過代謝工程修飾抗體寡糖，在細(xì)胞培養(yǎng)基中摻入巖藻糖類似物6-硫代過乙酸鹽，以這種方式在糖基的核心處引入巰基，巰基可以作為使用馬來酰亞胺化學(xué)連接連接子-載荷的錨定點(diǎn)。

2.3  酶工程化修飾抗體寡糖

     利用糖基轉(zhuǎn)移酶，主要是通過在糖基上引入一個(gè)新的反應(yīng)基團(tuán)，然后再利用相關(guān)試劑進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)。目前擁有酶工程糖基化偶聯(lián)技術(shù)的公司也有多家，包括Syniffix，康寧杰瑞和糖嶺生物等，但是具體使用的酶和linker接頭均有所不同。

    根據(jù)巖唐生物披露信息，其YTConju™技術(shù)平臺(tái)通過對(duì)抗體Fc區(qū)域保守的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行酶化學(xué)法改造，并利用高效的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和改構(gòu)后的巖藻糖衍生物實(shí)現(xiàn)了“一步法"偶聯(lián)。

    康寧杰瑞研發(fā)了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，基于抗體CH2結(jié)構(gòu)域糖鏈的定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)，采用一酶兩步法，核心步驟為在β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，UDP-GalNAz被轉(zhuǎn)移至抗體的末端已酰葡萄糖胺上，從而引入疊氮基團(tuán)，進(jìn)而為payload通過點(diǎn)擊化學(xué)的方法偶聯(lián)至抗體上。但對(duì)于抗體糖鏈末端的結(jié)構(gòu)如何做到統(tǒng)一（抗體制備過程控制策略），是否需額外修飾，并無太多信息披露。

康寧杰瑞

    Synaffix公司創(chuàng)建的GlycoConnect™技術(shù)，包括用EndoS修剪Fc糖鏈，隨后轉(zhuǎn)移GalNAz或疊氮-半乳糖基團(tuán)，以及最終點(diǎn)擊連接子-載荷。結(jié)合多種連接子-載荷選項(xiàng)，這項(xiàng)技術(shù)已被多家合作公司用來生成DAR 2的均質(zhì)gsADC。

3.  化學(xué)選擇性修飾（略）

4.  鄰近誘導(dǎo)抗體偶聯(lián)技術(shù)

    探針和蛋白質(zhì)的特定天然殘基（例如，賴氨酸、半胱氨酸、絲氨酸）之間進(jìn)行選擇性反應(yīng)的鄰近的偶聯(lián)方法正在成為一類重要的抗體偶聯(lián)方法。這些策略能夠制備位點(diǎn)特異性抗體偶聯(lián)物，而無需額外的抗體工程或額外修改。目前基于鄰近的偶聯(lián)的努力方向主要集中在新的鄰近誘導(dǎo)化學(xué)以及對(duì)抗體結(jié)構(gòu)和功能的破壞較小的抗體結(jié)合劑上。

5. 其他偶聯(lián)技術(shù)

    賴氨酸與半胱氨酸作為廣泛使用的靶標(biāo)，在化學(xué)反應(yīng)方面具有顯著優(yōu)勢。然而，異質(zhì)性問題對(duì)其藥效性質(zhì)產(chǎn)生了負(fù)面影響，進(jìn)而影響毒性表現(xiàn)。基于內(nèi)源性氨基酸的化學(xué)替代方法。其中，因酪氨酸、色氨酸、組氨酸的芳香族側(cè)鏈表現(xiàn)出du特的反應(yīng)性和選擇性，多種基于芳香族側(cè)鏈改性的化學(xué)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

5.1  蛋氨酸（ReACT）

    蛋氨酸是一種主要負(fù)責(zé)保護(hù)人體免受氧化應(yīng)激的氨基酸。因此，與其他氨基酸殘基相比，其功能化不太可能損害蛋白質(zhì)的功能。另一個(gè)優(yōu)勢是蛋氨酸的豐度較低(約1.8%)，這降低了特定標(biāo)記的概率。但發(fā)現(xiàn)所得蛋氨酸偶聯(lián)物的穩(wěn)定性一般，需要進(jìn)一步優(yōu)化才能成功應(yīng)用于ADC 領(lǐng)域。

5.2   酪氨酸

    廣泛的雙正交標(biāo)記策略是基于酪氨酸(Tyr)的苯酚側(cè)鏈上的選擇性化學(xué)。酪氨酸出現(xiàn)在蛋白質(zhì)序列的頻率中等 (自然豐度為3.3%)，從而為其du特的苯酚側(cè)鏈的位點(diǎn)選擇性標(biāo)記提供了機(jī)會(huì)。盡管酪氨酸通常部分埋藏在蛋白質(zhì)表面，但它也可以參與氫鍵，并且由于其氧化還原潛力，可以形成酪氨酸自由基，使電子轉(zhuǎn)移。因此，酪氨酸殘基經(jīng)歷了高度多樣化的生物修飾，如硝化、氧化、交聯(lián)、AMP化、鹵化或糖基化。