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Revvity小動物活體光學成像技術已在生命科學基礎研究、臨床前醫(yī)學研究及藥物 研發(fā)等領域得到廣泛應用。尤其藥物研發(fā)已經(jīng)是活體光學成像技術應用的熱點領域。 利用小動物光學成像技術可在活體水平 1.對治療腫瘤、炎癥、感染性疾病、神經(jīng)性 疾病等疾病的藥物藥效學進行評價；2.對藥物在動物體內(nèi)的分布代謝靶向進行研究 ；3.對進行評價。Revvity的小動物活體光學成像技術已廣泛應用于藥物的臨 床前研發(fā)階段，在藥物研發(fā)中應用已經(jīng)非常成熟，全球各大制藥企業(yè)均已采用活體光 學成像技術開展抗腫瘤、抗感染等藥物的研發(fā)，其中已有6種藥物獲得FDA認證，另有8種藥物處于臨床測試階段。
藥效學評價
1. 抗腫瘤藥物藥效學評價
抗腫瘤藥物藥效學評價是小動物光學成像技術的基礎應用之一，利用熒光素酶標 記腫瘤細胞，并移植入動物體內(nèi)建立腫瘤疾病動物模型，給藥后應用小動物活體光學 成像技術觀測腫瘤光學信號隨時間的變化情況，進而評價不同藥物、特定的給藥途 徑、時間、劑量等給藥策略對于腫瘤的治療效果，如下圖就利用小動物活體光學成像 技術評價了PD-0332991(PD-991)、阿瓦斯?。ˋvastin）、多西他賽（docetaxel，TXT） 的抗腫瘤效果。
藥效評價研究：利用螢火蟲熒光素酶標記MDA-MB-435乳腺癌細胞株，將細胞注入小鼠腎包膜下構(gòu)建腎包 膜腫瘤模型，進而對3種不同藥物或不同劑量的治療效果進行評價。（A,C）應用IVIS成像系統(tǒng)長期觀測3 種藥物對腎包膜乳腺癌移植瘤的治療效果，并進行定量分析，結(jié)果顯示30 mg/kg Docetaxel（TXT）對腫瘤 的生長抑制效果好；（B,D）應用IVIS成像系統(tǒng)長期觀測3種藥物對腎包膜乳腺癌移植瘤肺部轉(zhuǎn)移的抑 制效果，并進行定量分析，結(jié)果顯示30 mg/kg Docetaxel（TXT）對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制效果好。
Zhang et al.,Clin Cancer Res.2009;15(1):238-46.
相對于觸診、腫瘤體積測量等傳統(tǒng)方法，利用高靈敏度的生物發(fā)光成像技術進行 藥物評價，可以更靈敏的發(fā)現(xiàn)殘余病灶點或盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤的復發(fā)，從而更準確的對藥 物治療效果進行判定，如下例：
提高藥效評價準確性：利用螢火蟲熒光素酶標記PC-3M人前列腺腫瘤細胞株，建立腫瘤皮下移植模型進 行藥物評價。左圖：對照組，右圖：治療組。通過高靈敏度的生物發(fā)光成像技術可以準確檢測出藥物治療 后的殘余病灶點，從而進行正確的藥效評價，而如果通過觸診等傳統(tǒng)方法則可能做出錯誤判斷。
利用生物發(fā)光成像技術進行藥效評價的另一優(yōu)勢在于，可以明確判斷藥物是 否有效殺死腫瘤活細胞。這是由于生物發(fā)光的原理是基于活細胞環(huán)境的酶促反應，因 此，能夠發(fā)光的細胞必定是具有活性的。下圖所示為輝瑞公司抗腫瘤藥物Sutent的部 分研究結(jié)果，研究人員首先利用卡尺測量腫瘤體積的方法觀測該藥物對于腫瘤的生長 抑制情況，發(fā)現(xiàn)該藥物能夠延緩腫瘤的生長，但體積測量數(shù)據(jù)顯示腫瘤并未變小，研 究人員隨后利用生物發(fā)光成像技術進行觀測，發(fā)現(xiàn)給藥一定時間后腫瘤光學信號顯著 降低，說明該藥物對腫瘤活性細胞確實具有殺傷作用，同時說明單獨依靠腫瘤體積測 量的方式無法準確真實反映藥物治療效果。憑借活體光學成像的實驗結(jié)果，Sutent得以 順利通過FDA的認證。
2.抗感染藥物藥效學評價
研究者在健康和粒細胞減少CD-1小鼠腹腔注射細菌熒光素酶標記耐甲氧西林的金 黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MSSA）建立腹腔炎小 鼠模型。應用不同抗生素治療腹腔炎小鼠，Revvity的 IVIS系統(tǒng)成像顯示服用達托霉素 （Daptomycin）小鼠的生物發(fā)光強度顯著下降。結(jié)果說明達托霉素相對于其他抗生素 。
藥物（包括萘夫西林，萬古霉素，利奈唑胺）顯示更強和更快地殺菌活性，對腹 腔炎的治療效果更顯著。
Mortin et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2007,51(5): 787–1794
人乳頭瘤病（Human papillomavirus, HPV）誘導引發(fā)宮頸癌。螢火蟲熒光素酶 標記人乳頭瘤病皮膚感染的BALB/c小鼠模型，Revvity的 IVIS系統(tǒng)成像顯示病的 生物發(fā)光強度在皮下接種TA-CIN和GPI-0100疫苗的小鼠中明顯消失，說明這兩種疫 苗能夠極大地抑制人乳頭瘤病的生長（下圖）。
與細菌、病感染研究類似，研究者也可通過熒光素酶基因標記寄生蟲，觀測其 在活體動物體內(nèi)的感染情況。如Claes等人利用IVIS系統(tǒng)觀測了經(jīng)海腎熒光素酶基因 標記的布氏錐蟲（Trypanosoma brucei）在小鼠體內(nèi)的感染情況。體內(nèi)及體外成像結(jié)果 顯示，經(jīng)腹注射后，布氏錐蟲選擇性分布于睪丸。布氏錐蟲在睪丸的選擇性分布可能 會使其避開藥物的作用，因為許多藥物無法通過睪丸-血管屏障而進入睪丸。隨后的給 藥實驗印證了這種推斷，在布氏錐蟲感染小鼠5天后，用蟲草素（cordycepin）連續(xù)進 行三天處理，停藥后在第15天發(fā)現(xiàn)睪丸處重新出現(xiàn)布氏錐蟲生物發(fā)光信號。這一研究 為開發(fā)治療布氏錐蟲感染的有效藥物提供了依據(jù)。
3. 抗炎癥藥物藥效學評價
治療關節(jié)炎藥物藥效學評價：小分子 APO866 是 前 B 細胞集落增強因子（Pre-B cell colony-enhancing factor, PBEF ） / 煙 酰 胺 磷 酸 核 糖 轉(zhuǎn) 移 酶 （ nicotinamide phosphoribosyltransferase, NAMPT）抑制劑。為了研究前 B 細胞集落增強因子/煙酰胺 磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶在炎癥性關節(jié)炎疾病中的調(diào)節(jié)作用，研究者將膠原蛋白誘導的關節(jié)炎 小鼠灌輸APO866藥物。靜脈注射MMPSense750靶向的熒光試劑，監(jiān)測基質(zhì)金屬蛋白 酶活性而反映疾病炎癥。Revvity的 IVIS 系統(tǒng)成像顯示服用 APO0866 的小鼠金屬蛋白 酶活性下降，說明APO886能夠通過抑制前 B細胞集落增強因子/煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移 酶治療炎癥性關節(jié)炎。
治療系統(tǒng)炎癥藥物藥效學評價：小動物光學成像技術進行抗炎癥藥物的研究，主 要是借助炎癥光學動物模型即螢火蟲熒光素酶標記 NF- κB 基因的小鼠來實現(xiàn)， ( Nuclear factor-κB (NF- κB) 是細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，NF- κB 對細胞凋亡，腫瘤發(fā)生，自體 免疫疾病和炎癥有重要作用,NF- κB 的表達往往伴隨著炎癥的發(fā)生和發(fā)展。牛樟菇 (Antrodia camphorate)是產(chǎn)自中國臺灣的一種傳統(tǒng)中藥，牛樟菇可以治療食物中，藥物中，痢疾，腹痛，高血壓，皮膚瘙癢和肝癌，在此研究中主要評價牛樟菇對炎癥的治 療效果。模型小鼠通過腹腔內(nèi)注射脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）后建立炎癥的模 型，使用Revvity的 IVIS系統(tǒng)成像系統(tǒng)生物發(fā)光成像可實時檢測NF- κB在用藥前后的 表達水平，進而評價牛樟菇對炎癥的治療效果。從下圖可以看出小鼠服用牛樟菇后， 炎癥小鼠的生物發(fā)光強度下降（下圖左）。體外驗證顯示牛樟菇治療后腸系膜淋巴結(jié) ，肝臟，脾臟和腎臟的生物發(fā)光強度下降（下圖右）。結(jié)果說明牛樟菇能夠有效抑制 脂多糖引發(fā)的炎癥反應。
Hseu et al, Food and Chemical Toxicity, 2010(418):2319-2325
帕金森癥是一種神經(jīng)退化型疾病，神經(jīng)炎癥被認為在神經(jīng)細胞的損傷和凋亡過 程中起了很大作用。在大腦的黑質(zhì)致密部遞送抗炎癥和抗氧化劑可以有效的抑制神經(jīng) 炎癥和增加細胞活性，然而血腦屏障是進行大分子和蛋白質(zhì)遞送到大腦的主要屏障。 研究人員使用 MPTP 帕金森小鼠模型，進行納米制成的過氧化氫酶（Nanozyme, 抗炎 試劑）負載骨髓巨噬細胞的遞送。Revvity的 IVIS成像系統(tǒng)結(jié)果顯示，在骨髓巨噬細胞 的幫助下，過氧化氫酶可以成功的穿過血腦屏障進入到大腦，從而治療帕金森癥。
Brynskikh et al, Nanomedicine (2010) 5(3), 379–396
5.脂肪代謝相關藥物藥效學評價
ThermoMouse 是一種新的轉(zhuǎn)基因報告小鼠，可允許研究人員實時地研究活體動物 中的棕色脂肪活性。相關研究結(jié)果發(fā)表在最近一期的《Cell Reports》雜志。棕色脂肪 燃燒能量的這種能力，其關鍵是解偶聯(lián)蛋白1（UCP1），在該小鼠模型中當UCP1表達 時，熒光素酶隨之表達。因此通過生物發(fā)光檢測熒光素酶的表達，則可實時檢測UCP1 的表達，因此該模型可鑒定藥物對肥胖的治療效果。
Galmozzi et al., 2014, Cell Reports 9:1584–1593
減肥后脂肪量恢復的細胞過程具有普遍性，瘦素的mRNA水平與脂肪量有著密切 關系，因此瘦素的表達可以代表脂肪含量的改變。瘦素（Leptin，LP）是一種由脂肪組 織分泌的激素，人們之前普遍認為它進入血液循環(huán)后會參與糖、脂肪及能量代謝的調(diào) 節(jié)，促使機體減少攝食，增加能量釋放，抑制脂肪細胞的合成，進而使體重減輕。為 了進一步研究在不同條件下脂肪含量的變化，在此研究中建立了一種轉(zhuǎn)基因小鼠，在 該小鼠體內(nèi)重組的熒光素酶基因的表達受瘦素表達調(diào)節(jié)序列的調(diào)控，因此可以利用生 物發(fā)光來非侵入實時監(jiān)控瘦素的表達，從而衡量脂肪含量的變化，評價減肥藥物的使 用效果。研究結(jié)果表明，1、該轉(zhuǎn)基因小鼠瘦素的表達水平與熒光素酶活性高度一致， 可以通過活體成像檢測熒光素酶的表達來真實反映瘦素的表達量；2、在禁食后，重新 給予喂食6h后，瘦素表達增加，但是此時脂肪并未合成，因此提示脂-殆盡的脂肪細胞 在脂肪組織的滯留，在瘦素治療實驗中同樣驗證了這一論點。
藥物分布靶向研究
除了在藥效學中的應用，小動物活體光學成像也廣泛應用于藥物在體內(nèi)靶向、分 布及代謝的研究。與藥效學中的應用不同，此類應用是以藥物為直接觀測對象，因此 標記方式通常是利用熒光探針直接標記藥物本身，通過追蹤熒光信號而反映藥物在體 內(nèi)的分布情況。如在研究抗體或多肽類藥物是否能夠有效靶向腫瘤的實驗中，可以利 用熒光染料通過化學鍵的結(jié)合標記目標抗體或多肽，經(jīng)尾靜脈注射后，利用小動物活 體光學成像系統(tǒng)觀測上述標記對象的腫瘤靶向性，如下圖：
在研究藥物靶向的同時，了解不同時間點藥物在動物體各個器官的分布及最終代 謝情況同樣。Revvity的FMT小動物活體熒光斷層成像系統(tǒng)可以很好的滿足此 類應用需求。應用FMT成像系統(tǒng)，能夠?qū)晒鈽擞浀乃幬镌谏顚悠鞴俚姆植歼M行斷層 掃描及三維重建，獲得真實準確的三維定量數(shù)據(jù)，進而對藥物的體內(nèi)分布代謝情況作 出正確分析。如下圖：
在對藥物分布進行研究時尤其是小分子藥物，同位素標記被視為金標準。原因是 用相對大分子量的熒光染料標記小分子藥物，熒光染料本身即會對小分子藥物在體內(nèi) 的分布代謝產(chǎn)生影響，因此活體熒光成像技術并不是研究小分子藥物的最佳方法。 Revvity IVIS成像系統(tǒng)基于其超高的檢測靈敏度，可采集放射性同位素產(chǎn)生的切倫科夫 (Cerenkov)光信號，即帶電粒子在某特定介質(zhì)中以超過光在該介質(zhì)中的相速度運動時產(chǎn) 生藍光，利用這種現(xiàn)象對放射性同位素標記的小動物進行成像稱之為切倫科夫成像。 例如Jeong Chan Parka利用124I-標記藥物赫賽汀，尾靜脈注射荷瘤小鼠體內(nèi)后，利用 Revvity IVIS成像系統(tǒng)檢測其在腫瘤的分布。
切倫科夫輻射成像：應用IVIS成像系統(tǒng)結(jié)合[18F]FDG放射性探針觀測腫瘤。A.腫瘤生物發(fā)光成像結(jié)果；B. 應用IVIS系統(tǒng)進行切倫科夫輻射成像，觀測不同時間點[18F]FDG在腫瘤部位的代謝；C.應用PET系統(tǒng)成 像，觀測不同時間點[18F]FDG在腫瘤部位的代謝，結(jié)果與B一致。
事實上，直接通過熒光染料標記藥物注入體內(nèi)的方式存在諸多問題，如低靶向 性、低藥效性、免疫排斥、藥物性問題等。因此，構(gòu)建新型藥物載體也是目前藥物 研究的熱點之一，應用小動物活體光學成像技術同樣可以在這一領域發(fā)揮作用。如下 圖所示為研究人員通過小動物活體光學成像技術觀測一種新型納米共聚物給藥載體在 體內(nèi)運載嗎啉基反義寡核苷酸靶向治療腫瘤的實驗。此類給藥載體包含多種組分，如 起整體保護作用的外層多聚蘋果酸骨架及聚乙二醇、起腫瘤靶向作用的抗體連接組 分、藥物釋放組分、熒光染料結(jié)合位點等。結(jié)果表明，通過應用新型納米給藥載體可 以有效提升藥物的靶向治療效果。
藥物性研究
除了進行藥物靶向及分布代謝研究之外，小動物光學成像技術還可用于評價藥物 的性。其中肝性評價是藥物研發(fā)的一個關鍵模塊，而許多藥物在臨床研究甚至上 市后才發(fā)現(xiàn)嚴重肝性，這對藥物開發(fā)公司和用藥患者都帶來了巨大的損害。斯坦福 大學Shuhendler教授在2014年發(fā)表一篇文章，在文章中就設計并研發(fā)了一種藥物肝性指示劑，可以根據(jù)藥物肝性的大小，發(fā)出不同的光。其原理是基于肝性的兩個關 鍵生物標志物——活性氧（reactive oxygenspecies,ROS）和活性氮（reactive nitrogen species,RNS），二者的產(chǎn)生機制不同，因此對兩者同時檢測可廣泛的檢測藥物的。此指示劑是一種半導體聚合物納米粒（semiconducting polymer nanoparticle,SPN），包含三個核心元件：（1）靶向元件：通過聚乙二醇聯(lián)連接半乳糖 殘基，可以與肝細胞表面的半乳糖受體結(jié)合，是一種常見的肝靶向方法；（2 ）活性氧 感應元件：化學發(fā)光劑雙草酸酯（ CPPO） 在活性氧存在的條件下，迅速分解產(chǎn)生高能 中間體1,2-二氧雜環(huán)丁烷二酮，激發(fā)附近染料分子發(fā)光，檢測發(fā)出的光子強度即可評價 活性氧的程度；（3）活性氮感應元件：青色素染料IR775S發(fā)射680nm、820nm兩種熒 光，因熒光能量偏振轉(zhuǎn)移（FRET），發(fā)射的680nm的光子作為激發(fā)光激發(fā)染料分子發(fā) 射出820nm的光，而680nm光子減弱甚至消失；而在活性氮存在的條件下，F(xiàn)RET現(xiàn)象 消失680nm熒光信號增強，檢測此信號的強度即可評價活性氮的強度。
Nat Biotechnol. 2014 April ; 32(4): 373–380.
同樣也可以通過監(jiān)測與機體損傷相關基因的表達來評價藥物的性。其中血紅素 氧化酶1（Heme oxygenase-1，HO-1）就是一個關鍵的檢測目標。物質(zhì)代謝、能量代 謝、藥物和物的生物轉(zhuǎn)化，都涉及氧化還原過程，并伴隨大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的生成，而剛才也提到活性氧已經(jīng)被認為是藥物性的一個標 志。大量研究顯示，凡引起細胞ROS 水平增加的外來刺激，如性藥物、重金屬、 素等，大都能使HO-1的表達增加，起到抗氧化的作用，因此HO-1基因的表達可以用來評價藥物的性。將熒光素酶的基因插入小鼠HO-1基因啟動子下游建立HO-1-Luc 轉(zhuǎn)基因小鼠，即可應用生物發(fā)光的成像模式實時檢測HO-1基因的表達，進而評價藥物 的性。 如下圖所示
Weisheng Zhang.et al.J Mol Med (2002) 80:655–664
血清淀粉樣蛋白A(Serum amyloid A,SAA)是一種急性期反應蛋白，血中濃度主要 由合成速度決定，而肝功能正常時其合成主要決定于細胞因子的水平。當組織發(fā)生感 染、炎癥或者損傷時，SAA可以誘導產(chǎn)生組織損傷修復過程所需的酶，吸引免疫細胞 到達炎癥部位加強免疫反應作用。若藥物會引發(fā)機體產(chǎn)生損傷或炎癥時，SAA的表達 會迅速上升，因此SAA也可以作為藥物性的一個標志物。同樣我們建立SAA-Luc轉(zhuǎn) 基因小鼠即可評價藥物對肝臟的性，如下圖所示:
藥物代謝酶CYP3A在藥物代謝中發(fā)揮重要的作用，藥物對CYP3A的誘導表達可 加速合用藥物的代謝，因此CYP3A的表達水平可以評價藥物在肝臟的代謝情況。在進 行實驗時，可將熒光素酶基因重組到小鼠CYP3A基因的表達盒中，構(gòu)建CYP3A-luc轉(zhuǎn) 基因小鼠，當藥物經(jīng)過肝臟進行代謝時，CYP3A的表達增高，同樣熒光素酶的表達也 隨之增加，在注射底物熒光素時，即可產(chǎn)生生物發(fā)光的信號，信號的強度即代表了藥 物肝代謝的水平。目前CYP3A4-Luc轉(zhuǎn)基因小鼠，并且已經(jīng)被用于快速、大量篩選觀 察藥物在肝臟代謝情形及中草藥對藥物代謝的影響。
W. Zhang et al.Biochemical Pharmacology 65 (2003) 1889–1896
