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單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是DNA序列中單個核苷酸替換導(dǎo)致的，通常SNP位點構(gòu)成兩個等位基因。在人類基因組中，具有豐富的SNPs，據(jù)預(yù)測每1000個堿基就會有1個SNP發(fā)生。SNPs位點與許多人類疾病相關(guān)，包括癌癥、代謝疾病、自身免疫疾病、神經(jīng)性疾病、傳染病等。另外，研究SNPs對畜牧養(yǎng)殖、農(nóng)作物育種也有非常重要的意義。對于SNPs分型分析除了傳統(tǒng)的DNA測序、毛細管電泳、質(zhì)譜、色譜法，我們還可以通過EnVision多功能酶標儀的多種檢測模式進行高通量SNPs分型分析。
方案一
經(jīng)典的FP-TDI單核苷酸多態(tài)性檢測
FP-TDI(template-directed dye-terminator incorporation assay with FP detection)是經(jīng)典的SNPs分型檢測方法，如下圖，定序引物是一種未經(jīng)修飾的引物，其3’端靠近多態(tài)或突變位點的上游。當(dāng)加入不同熒光團標記的ddNTP、DNA聚合酶和靶標DNA孵育時，等位基因特異性標記ddNTP與TDI引物結(jié)合。激發(fā)反應(yīng)中的熒光染料來檢測FP信號的變化，可以簡單快速地確定靶標DNA分子的基因型。應(yīng)用EnVision FP檢測模式，不論是單鏈合成DNA寡聚核苷酸還是PCR擴增產(chǎn)物雙鏈DNA片段，都可以作為FP-TDI檢測模板，檢測方法的高靈敏、高特異性得到驗證。
方案二
AlphaScreen均相SNPs分型檢測技術(shù)
AlphaScreen技術(shù)可用于開發(fā)高通量核酸檢測，如下圖，通過通用寡核苷酸將探針分別橋聯(lián)在供體和受體微珠上，通過探針結(jié)合靶基因序列達到檢測目的 。這種方法可以檢測到濃度低至10amole的單鏈DNA。AlphaScreen與等位基因特異性擴增（ASA）和等位基因特異性雜交（ASH）的結(jié)合，可開發(fā)兩種均相單核苷酸多態(tài)性（SNP）基因分型平臺。這兩種類型的檢測都非常靈活、穩(wěn)定、準確，每個基因型的基因組DNA樣本含量僅需2ng。使用ASA分析對12個SNPs和使用ASH分析的7個SNPs進行了AlphaScreen驗證研究。580多個樣本進行了基因分型，準確率>99%。這兩種檢測方法非常簡單，不需要PCR后操作。在96孔和384孔板中成功地進行了基因分型，體積低至2μL，大大減少了基因分型所需的試劑和基因組DNA的數(shù)量。
方案三
基于化學(xué)發(fā)光雙報告基因檢測的SNPs功能分析
SNPs調(diào)控的蛋白表達，在畜牧養(yǎng)殖、育種有著非常重要的意義。β-乳球蛋白是牛奶中主要的乳清蛋白，約占牛奶總蛋白的10%，但有可能導(dǎo)致食用后過敏。一項關(guān)于雜合子奶牛乳汁中BLG B亞型濃度的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）檢測到BLG基因內(nèi)或附近存在一組高度顯著的單核苷酸多態(tài)性（SNP）。其中BLG基因第1外顯子+78 bp處存在同義G/a突變（chr11:103256256G>a）。在轉(zhuǎn)染的CHO-K1和MCF-7細胞中的熒光素酶報告分析中評估了該SNP的A等位基因（稱其為B’）對BLG表達的影響，通過EnVision化學(xué)發(fā)光雙報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，B’純合子大大降低BLG蛋白表達量。另外發(fā)現(xiàn)，攜帶B’ BLG等位基因奶牛產(chǎn)奶所含的酪蛋白含量非常高，有助于提供乳酪產(chǎn)量。因此，通過高通量SNPs篩選，可以獲得優(yōu)良的品種。
