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聚合酶鏈式反應（PCR）關鍵要素詳解
閱讀：83 發(fā)布時間：2025-6-25PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈式反應是一個強大的分子生物學技術，用于擴增特定的DNA片段。PCR反應指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，體系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、擴增增強因子，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。PCR反應將微量目的DNA片段擴增一百萬以上，它以敏感度高，特異強，產率高，重復好，以快速簡便優(yōu)點迅速成分子生物學研究中最為廣泛的方法。
PCR反應的成功依賴于五個關鍵要素：
1. 引物：
1) 引物是一段短的DNA序列，用于與目標DNA模板的特定區(qū)域配對。
2) 設計原則包括長度（1530 bp）、G+C含量（40%60%）、避免二級結構和引物間互補等。
3) 通常每條引物的濃度為0.10.5 μmol/L，過高可能導致非特異性擴增。
2. 模板DNA：
是待擴增的DNA序列，可以是基因組DNA、cDNA或質粒DNA。
數量和純度對結果至關重要，通常使用102105拷貝，但過量可能增加非特異性產物。
單鏈和雙鏈DNA均可作為模板，但線性DNA比環(huán)狀DNA擴增效果更好。
3. DNA聚合酶：
1) 負責催化DNA合成，常用的是Taq DNA聚合酶，因其耐高溫特性。
2) 其他如Pfu、Phusion等酶具有更高保真度，適用于特定應用。
3) 酶的濃度通常為1.02.5 U/100 μL反應液，過高或過低均影響擴增效率。
4. dNTPs（脫氧核苷三磷酸）：
1) 作為DNA合成的原料，通常等量加入反應體系，終濃度為20200 μmol/L。
2) 濃度過高可能抑制Taq酶活性，影響產物特異性。
5. Mg2+：
1) 作為DNA聚合酶的輔助因子，影響酶活性和產物特異性。
2) 終濃度通常為0.52.5 mmol/L，需要根據引物Tm值和dNTP濃度調整。
此外，PCR反應還需要緩沖液提供適宜的pH和離子環(huán)境，以及適當的溫度控制（變性、退火、延伸三個階段）來完成循環(huán)擴增。