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靈芝酸DM173075-45-1標(biāo)準(zhǔn)品/對照品采用細(xì)胞培養(yǎng)和T-A克隆技術(shù),在輪狀病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白VP7基因序列上設(shè)計(jì)合成引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增后將特異性產(chǎn)物連接入pGEM-T-easy載體中,經(jīng)過酶切鑒定和測序分析獲得輪狀病毒cDNA標(biāo)準(zhǔn)品.  利用常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)定量PCR方法對所獲得的cDNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性指標(biāo)的檢驗(yàn).

結(jié)果表明,利用此標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較高的擴(kuò)增效率和良好的線性關(guān)系(斜率為-3.353,R2=0.995);實(shí)時(shí)定量PCR熔解曲線分析表明,溫度在81℃±0.5℃的PCR產(chǎn)物是輪狀病毒VP7序列上的特異性產(chǎn)物,表明此標(biāo)準(zhǔn)品是輪狀病毒特異性的;

同時(shí),所制備的標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)時(shí)定量PCR檢測中具有較大的線性范圍(9×100~9×1011copies/μL,每個(gè)反應(yīng)低可以檢測到9個(gè)拷貝數(shù)的輪狀病毒cDNA,表明利用該標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析時(shí)具有較高的檢測靈敏性;

此外,該標(biāo)準(zhǔn)品具有較高的穩(wěn)定性和重復(fù)性(3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)CV值在0.2%~0.9%之間),可長期穩(wěn)定保存.構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品可用作檢測水環(huán)境中輪狀病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的外標(biāo)準(zhǔn)品.

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