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蛋白定量BCA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)干貨分享

閱讀:493          發(fā)布時(shí)間:2025-3-17

       BCA(Bicinchoninic Acid)法是一種常用的蛋白定量檢測(cè)方法,其原理是利用蛋白質(zhì)與銅離子在堿性溶液中發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),生成穩(wěn)定的紫紅色復(fù)合物,再與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較,即可求出待測(cè)蛋白的濃度。該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)等領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)步驟:

1.試劑準(zhǔn)備

(1)BCA工作液:將BCA試劑A和B按50:1的比例混合,充分搖勻,備用。

(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液:取適量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白,用PBS或去離子水溶解,配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。

2.蛋白樣品制備

(1)細(xì)胞裂解:將細(xì)胞樣品離心,去除上清液,加入適量的細(xì)胞裂解液,在冰上裂解30min,使細(xì)胞充分裂解。

(2)去除雜質(zhì):將裂解后的樣品離心,去除沉淀,保留上清液。在上清液中加入適量的SDS,使終濃度為0.1%,充分混勻。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:取適量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,加入適量的SDS,使終濃度為0.1%,然后分別稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。取96孔板,分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在每個(gè)孔中加入BCA工作液,充分混勻。然后按照說(shuō)明書要求,在特定波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.蛋白定量檢測(cè)

(1)取適量的待測(cè)蛋白樣品,加入適量的SDS,使終濃度為0.1%,充分混勻。然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法,加入BCA工作液,測(cè)量吸光度值。

(2)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,查找出待測(cè)蛋白樣品的濃度。如果待測(cè)蛋白樣品濃度較高,可以進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

注意事項(xiàng):

1.BCA工作液應(yīng)儲(chǔ)存于4℃避光保存,避免反復(fù)凍融。

2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)保持樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的pH值一致,以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免交叉污染,以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4.對(duì)于一些特殊的蛋白質(zhì)樣品,可能需要采用其他方法進(jìn)行定量檢測(cè)。

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