化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
原代細(xì)胞培養(yǎng)液顏色的變化
閱讀：1288 發(fā)布時間：2018-7-3 顯微鏡觀察待轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞的生長狀態(tài)
a. 觀察細(xì)胞是否污染
b. 觀察培養(yǎng)液顏色的變化
c. 觀察細(xì)胞的生長密度
2） 轉(zhuǎn)染
a. 用微量移液器在1.5ml離心管中依次加入10μg（1μg /μl, 10μl）質(zhì)粒DNA（實驗組為TNF-R1的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，對照組為空載體），350μl超純水，40μlCaCl2（2.5M）溶液，混勻。
b. 在另一1.5ml離心管中加入400μl2×HBS，將A液分三次緩慢加入，每次加入A液后用吹氣泡的方法混勻。室溫靜置5分鐘。
c. 將A，B混合液均勻地滴加在待轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕晃動使混勻。將培養(yǎng)皿置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中。
3. 凋亡細(xì)胞的形態(tài)觀察，“DNA Ladder”的提取及瓊脂糖電泳分析（第三天）
1） 顯微鏡觀察過量表達(dá)TNF-R1（實驗組）和空載體（對照組）的293細(xì)胞形態(tài)上的差異。
2） 用10ml玻璃吸管將實驗組和對照組培養(yǎng)皿中的細(xì)胞輕輕吹打下來，收集到15ml離心管中，2000rpm離心5分鐘，沉淀用1mlPBS重懸，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，2000rpm離心3分鐘，去除上清液，加入200μlPBS（0.2mg/ml 蛋白酶 K），重懸原代細(xì)胞，再加入200μlPBS（2％NP40），顛倒混勻，4°C作用30分鐘，期間顛倒數(shù)次。12,000rpm離心2分鐘，吸出上清，加入1ml乙醇，顛倒混勻，－20°C靜置10分鐘，12,000rpm離心10分鐘，沉淀溶于50μl水中，加入RNaseA（10mg/ml），37°C靜置20分鐘。
3） 在DNA溶液中加入10μlDNA上樣緩沖液，取出50μl進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照。
信號通路Wnt9aIgG 大鼠骨鈣素/骨谷氨酸蛋白(OT/BGP)
信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子2(STAT2)IgG 大鼠骨成型蛋白受體Ⅱ(BMPR-Ⅱ)
信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3IgG 大鼠骨成型蛋白受體1A(BMPR-1A)
信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子4IgG 大鼠骨成型蛋白7(BMP-7)
信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(STAT5)IgG 大鼠骨成型蛋白4(BMP-4)
信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6IgG 大鼠骨成型蛋白4(BMP-4)
信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1IgG 大鼠骨成型蛋白2(BMP-2)
星形膠質(zhì)細(xì)胞PEA15IgG 大鼠骨保護(hù)素配體(OPGL)
性激素結(jié)合球蛋白IgG 大鼠骨保護(hù)素(OPG)
原代細(xì)胞