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上皮細(xì)胞類培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
閱讀：205 發(fā)布時間：2018-12-11| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 250.8KB |
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上皮細(xì)胞可來源于外，內(nèi)、中三個胚層；但培養(yǎng)中只有源于外和內(nèi)胚層的細(xì)胞能反映出上皮細(xì)胞的特征細(xì)胞呈膜狀生長的特點(diǎn)。而間皮和內(nèi)皮剛接種培養(yǎng)和細(xì)胞量少時常呈成纖維細(xì)胞型，只有細(xì)胞數(shù)量較多時，才能顯出膜狀特點(diǎn)。內(nèi)容來源：組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)
實(shí)驗(yàn)方法原理 利于皮膚表皮細(xì)胞培養(yǎng)成功的因素有，在有膠原的底物上易生長；另有人發(fā)現(xiàn)把人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3 細(xì)胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）上時，細(xì)胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低pH、Ca2+的含量和溫度等，均利于表皮細(xì)胞生長。向培養(yǎng)基中加（ 10 μg/ml ）、10-10 的霍亂毒素、10M-6 的異丙基腎上腺素（Isopro-terenol）和10 ng/mI 促表皮生長因子（EGF）能促表皮細(xì)胞生長。
實(shí)驗(yàn)材料 皮膚血清
試劑、試劑盒 EDTA胰蛋白酶Eagle
儀器、耗材 血管鉗吸管CO2溫箱
實(shí)驗(yàn)步驟
皮膚是皮表細(xì)胞培養(yǎng)來源，小兒包皮是皮膚表皮細(xì)胞培養(yǎng)的好材料。全皮培養(yǎng)時，表皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合生長，難以純化。黑木登志夫（1981）用皮膚表皮和分離培養(yǎng)法可獲純上皮細(xì)胞，有一定參考價值，其法如下：
1. 取材
取外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，切成 0.5~1 平方厘米小塊；
2. EDTA處理
先置入0.02 %EDTA 中室溫置5 分鐘；
3. 冷消化
換入0.25 %胰蛋白酶中，置4 ℃過夜；
4. 分離
取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與層分開；
5. 溫消化
取出表皮單獨(dú)處理，用剪刀剪成更小的塊后，置入新的0.25 %胰蛋白酶中，37 ℃再消化30~60 分鐘；
6. 用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細(xì)胞懸液；
7. 培養(yǎng)液
通過80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸上清，直接加入Eagle液和 20 %小牛血清，制成細(xì)胞懸液，接種入碟皿中，CO2溫箱培養(yǎng)。
上皮細(xì)胞可來源于外，內(nèi)、中三個胚層；但培養(yǎng)中只有源于外和內(nèi)胚層的細(xì)胞能反映出上皮細(xì)胞的特征細(xì)胞呈膜狀生長的特點(diǎn)。而間皮和內(nèi)皮剛接種培養(yǎng)和細(xì)胞量少時常呈成纖維細(xì)胞型，只有細(xì)胞數(shù)量較多時，才能顯出膜狀特點(diǎn)。內(nèi)容來源：組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)
實(shí)驗(yàn)方法原理 利于皮膚表皮細(xì)胞培養(yǎng)成功的因素有，在有膠原的底物上易生長；另有人發(fā)現(xiàn)把人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3 細(xì)胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）上時，細(xì)胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低pH、Ca2+的含量和溫度等，均利于表皮細(xì)胞生長。向培養(yǎng)基中加（ 10 μg/ml ）、10-10 的霍亂毒素、10M-6 的異丙基腎上腺素（Isopro-terenol）和10 ng/mI 促表皮生長因子（EGF）能促表皮細(xì)胞生長。
實(shí)驗(yàn)材料 皮膚血清
試劑、試劑盒 EDTA胰蛋白酶Eagle
儀器、耗材 血管鉗吸管CO2溫箱
實(shí)驗(yàn)步驟
皮膚是皮表細(xì)胞培養(yǎng)來源，小兒包皮是皮膚表皮細(xì)胞培養(yǎng)的好材料。全皮培養(yǎng)時，表皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合生長，難以純化。黑木登志夫（1981）用皮膚表皮和分離培養(yǎng)法可獲純上皮細(xì)胞，有一定參考價值，其法如下：
1. 取材
取外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，切成 0.5~1 平方厘米小塊；
2. EDTA處理
先置入0.02 %EDTA 中室溫置5 分鐘；
3. 冷消化
換入0.25 %胰蛋白酶中，置4 ℃過夜；
4. 分離
取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與層分開；
5. 溫消化
取出表皮單獨(dú)處理，用剪刀剪成更小的塊后，置入新的0.25 %胰蛋白酶中，37 ℃再消化30~60 分鐘；
6. 用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細(xì)胞懸液；
7. 培養(yǎng)液
通過80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸上清，直接加入Eagle液和 20 %小牛血清，制成細(xì)胞懸液，接種入碟皿中，CO2溫箱培養(yǎng)。
上皮細(xì)胞可來源于外，內(nèi)、中三個胚層；但培養(yǎng)中只有源于外和內(nèi)胚層的細(xì)胞能反映出上皮細(xì)胞的特征細(xì)胞呈膜狀生長的特點(diǎn)。而間皮和內(nèi)皮剛接種培養(yǎng)和細(xì)胞量少時常呈成纖維細(xì)胞型，只有細(xì)胞數(shù)量較多時，才能顯出膜狀特點(diǎn)。內(nèi)容來源：組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)
實(shí)驗(yàn)方法原理 利于皮膚表皮細(xì)胞培養(yǎng)成功的因素有，在有膠原的底物上易生長；另有人發(fā)現(xiàn)把人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3 細(xì)胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）上時，細(xì)胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低pH、Ca2+的含量和溫度等，均利于表皮細(xì)胞生長。向培養(yǎng)基中加（ 10 μg/ml ）、10-10 的霍亂毒素、10M-6 的異丙基腎上腺素（Isopro-terenol）和10 ng/mI 促表皮生長因子（EGF）能促表皮細(xì)胞生長。
實(shí)驗(yàn)材料 皮膚血清
試劑、試劑盒 EDTA胰蛋白酶Eagle
儀器、耗材 血管鉗吸管CO2溫箱
實(shí)驗(yàn)步驟
皮膚是皮表細(xì)胞培養(yǎng)來源，小兒包皮是皮膚表皮細(xì)胞培養(yǎng)的好材料。全皮培養(yǎng)時，表皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合生長，難以純化。黑木登志夫（1981）用皮膚表皮和分離培養(yǎng)法可獲純上皮細(xì)胞，有一定參考價值，其法如下：
1. 取材
取外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，切成 0.5~1 平方厘米小塊；
2. EDTA處理
先置入0.02 %EDTA 中室溫置5 分鐘；
3. 冷消化
換入0.25 %胰蛋白酶中，置4 ℃過夜；
4. 分離
取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與層分開；
5. 溫消化
取出表皮單獨(dú)處理，用剪刀剪成更小的塊后，置入新的0.25 %胰蛋白酶中，37 ℃再消化30~60 分鐘；
6. 用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細(xì)胞懸液；
7. 培養(yǎng)液
通過80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸上清，直接加入Eagle液和 20 %小牛血清，制成細(xì)胞懸液，接種入碟皿中，CO2溫箱培養(yǎng)。
收起
注意事項(xiàng)
冷消化目的在于使表皮和結(jié)合松散，如冷消化后分離下來的表皮膜自身也已松散，此時亦可直接置入PBS中用吸管吹打制備細(xì)胞懸液；不再經(jīng)過第二次消化。
其他
皮膚表皮培養(yǎng)亦可用全皮消化法或組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。用膠原酶消化為好，它對結(jié)締組織有較強(qiáng)消化作用，對表皮細(xì)胞損傷小，但成纖維細(xì)胞易與上皮細(xì)胞同時生長，在這種情況下，需做排除成纖維胞處理。血清中含有血小板來源的生長因子（PDGF），易促成纖維細(xì)胞的生長；如用好的、不含PDGF的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)可能更好。
收起
注意事項(xiàng)
冷消化目的在于使表皮和結(jié)合松散，如冷消化后分離下來的表皮膜自身也已松散，此時亦可直接置入PBS中用吸管吹打制備細(xì)胞懸液；不再經(jīng)過第二次消化。
其他
皮膚表皮培養(yǎng)亦可用全皮消化法或組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。用膠原酶消化為好，它對結(jié)締組織有較強(qiáng)消化作用，對表皮細(xì)胞損傷小，但成纖維細(xì)胞易與上皮細(xì)胞同時生長，在這種情況下，需做排除成纖維胞處理。血清中含有血小板來源的生長因子（PDGF），易促成纖維細(xì)胞的生長；如用好的、不含PDGF的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)可能更好。
收起
注意事項(xiàng)
冷消化目的在于使表皮和結(jié)合松散，如冷消化后分離下來的表皮膜自身也已松散，此時亦可直接置入PBS中用吸管吹打制備細(xì)胞懸液；不再經(jīng)過第二次消化。
其他
皮膚表皮培養(yǎng)亦可用全皮消化法或組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)。用膠原酶消化為好，它對結(jié)締組織有較強(qiáng)消化作用，對表皮細(xì)胞損傷小，但成纖維細(xì)胞易與上皮細(xì)胞同時生長，在這種情況下，需做排除成纖維胞處理。血清中含有血小板來源的生長因子（PDGF），易促成纖維細(xì)胞的生長；如用好的、不含PDGF的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)可能更好。