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PCR引物溶解稀釋方法
閱讀：2600 發(fā)布時間：2018-8-7在實驗室進行分子克隆實驗時，經常需要合成大量的引物，而這些合成的引物首先要進行適當的稀釋才能使用。如果不稀釋就使用引物，往往造成引物的浪費和過早的活性喪失，更有一些被污染而不能使用。
因此，建議對合成的引物先進行稀釋，然后使用。稀釋的引物利于保存和應用。
現(xiàn)將方法簡單敘述如下：
1. Oligo DNA是以OD260單位來計算的，這是指在1ml體積1cm光程標準比色皿中，260nm波長下吸光度為1A260的Oligo溶液定義為1 OD260單位，根據此定義，1 OD260單位相當于33μg的Oligo DNA，您可以根據此數據和您的Oligo DNA分子量，計算得到摩爾數以計算不同摩爾濃度的溶液。
2. 引物序列的分子量計算公式如下：
MW=（A堿基數×312）+（C堿基數×288）+（G堿基數×328）+（T堿基數×303）-61
例如：引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG A=1 C=3 G=11 T=6
MW=（1×312）+（3×328）+（6×303）-61=6541
3. Oligo DNA的分子量也可以用以下近似方法計算：Oligo DNA中的每個脫氧核苷酸堿基的平均分子量近似為324.5，則一條Oligo DNA的分子量=堿基數×324.5。
例：
您得到一管標為5 OD260的20 mer Oligo DNA
分子量=20×324.5=6490
質量數=5×33=165μg
摩爾數=165/6490=0.025μmol=25nmol
若加滅菌雙蒸水400μl溶解，則濃度為25nmol/400μl=62.5μM
4. 裝有引物的eppendorf管一般保存于-20℃，臨用前稀釋。
5. 由于Oligo DNA呈很輕的干膜狀附在管壁上，打開時極易散失，所以打開管子前請先離心10,000rpm,1min,然后再慢慢打開管蓋。
6. 在裝有引物的eppendorf管內加入100-500μl雙蒸水，蓋上管蓋，充分上下振蕩5-10分鐘，再次離心10,000rpm,1min。
7. 計算原引物管primer的濃度（必要時測OD260核對廠家提供引物量是否正確）。
8. 計算并將應用primer稀釋為10pmol/μl。
9. 標明原引物管、應用引物管、稀釋方法，置-20℃保存。