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還原型谷胱甘肽（reduced glutathione）試劑盒說明書

                                                        分光光度法50管/48樣

 

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

GSH是細胞內最主要的抗氧化巰基物質，在抗氧化、蛋白質巰基保護和氨基酸跨膜運輸?shù)戎芯哂兄匾饔?。還原型與氧化型比值（GSH/GSSG）是細胞氧化還原狀態(tài)的主要動態(tài)指標。因此，測定細胞內GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態(tài)。

 

測定原理：

DTNB與GSH反應生成復合物，在412nm處有特征吸收峰；其吸光度與GSH含量成正比。

 

自備儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調節(jié)移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

 

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體×1瓶，4℃避光保存。

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粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

 

GSH測定操作：

1. 分光光度計預熱30min，調節(jié)波長到412 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴中保溫30min。

3. 空白管：取1mL玻璃比色皿，依次加入100μL蒸餾水，700μL試劑二，200μL試劑三，混勻靜置2min后測定412 nm吸光度A1。

4. 測定管：取1mL玻璃比色皿，依次加入100μL上清液，700μL試劑二，200μL試劑三，混勻靜置2min后測定412 nm吸光度A2。

注意：空白管只需要測定一次。

 

GSH含量計算公式：

GSH標準曲線公式：y=1.5 x（x為GSH濃度，μ mol /mL；y為吸光值）

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GSH計算：

（1）按蛋白濃度計算

GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷1.5×V樣÷（V樣×Cpr ）=0.667×(A2－A1) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

GSH（μ mol/g鮮重）=(A2－A1) ÷1.5×V樣÷(V樣÷V樣總×W)=0.667×(A2－A1) ÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

GSH（μ mol /10⁴ cell）=(A2－A1) ÷1.5×V樣÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量)=0.667×(A2－A1) ÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

GSH（μ mol/ mL）=(A2－A1) ÷1.5×V樣÷V樣 =0.667×(A2－A1)

V樣總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入反應體系中上清液體積，100μL=0.1 mL；W：樣品質量，g ；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；

 

注意事項：

1. 試劑一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。

2. 檢出限為0.01mmol/L。

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