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已凍存細胞的傳代培養(yǎng)
閱讀：635 發(fā)布時間：2018-7-13實驗試劑
細胞培養(yǎng)液成分為RPMI1640基本培養(yǎng)液 10%胎牛血清 1%三抗，PBS，凍存培養(yǎng)液(含10%DMSO或甘油)，Trypsine-EDTA消化液，液氮
實驗設(shè)備
水浴鍋，35mm培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)箱，無菌凍存管，低溫冰箱，超低溫冰箱
實驗材料
已凍存的HEK293和HeLa細胞
實驗步驟
1. 細胞的復(fù)蘇
1) 保存細胞的冷凍管直接投入37℃溫水，不時搖動令其盡快融化，解凍1分鐘；
2) 取出冷凍管，用酒精消毒后打開管蓋，吸出細胞懸液，注入離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混合后低速離心，除去上清液，再用培養(yǎng)液重復(fù)洗一次；
3) 用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種35mm培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打混勻后，放在37℃的培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
2. 細胞的傳代(貼壁細胞的消化法)
1) 吸出皿內(nèi)舊的培養(yǎng)基，加PBS于皿中，清洗兩次，用于洗去瓶內(nèi)殘存的血清，以防止血清對胰蛋白酶活性的影響；
2) 加0.2ml Trypsine-EDTA消化液輕輕搖動，使消化液流遍所有細胞表面充分消化細胞，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后，立刻終止消化；
3) 吸出消化液，再加培養(yǎng)液，反復(fù)吹打至沒有細胞團。吹打動作要輕柔，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，這些都會對細胞有損傷。將細胞懸液接種到新的培養(yǎng)皿中。
3. 細胞的凍存
1) 從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，是對數(shù)生長期細胞，已經(jīng)長滿的細胞凍存后生存率低。凍存前一天換一次培養(yǎng)液；
2) 用Trypsin-EDTA把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則不需處理。依據(jù)傳代方法把消化好的細胞收集于離心管并計數(shù)離心；
3) 去除Trypsin-EDTA，加入配制好的凍存培養(yǎng)液(含10%DMSO或甘油)，凍存液中細胞的終密度為106/ml-107/ml。用吸管輕輕吹打使細胞均勻，然后分裝入無菌凍存管，每個凍存管加液1-1.5ml。凍存管上標(biāo)明細胞的名稱；
4) 把凍存管放入4℃冰箱30min；然后轉(zhuǎn)移至-20℃2h；隨后將凍存管轉(zhuǎn)移到-80℃過夜；第二天迅速浸入液氮中長期保存。要適當(dāng)掌握降溫速度，過快會影響細胞內(nèi)水分的滲出，太慢則促進冰晶的形成。