細(xì)胞永生化是癌變的必經(jīng)途徑，通過(guò)人為干涉如放射處理、端粒酶激活、病毒基因轉(zhuǎn)染等方法實(shí)現(xiàn)。永生化細(xì)胞具有科研價(jià)值，如作為研究細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老等的理想模型，節(jié)省分離細(xì)胞的周期和成本，是研究腫瘤發(fā)生機(jī)制的重要模型，并可建立穩(wěn)定細(xì)胞庫(kù)提供一致且可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

基本的細(xì)胞系永生化工作流程：

細(xì)胞永生化的方法：

細(xì)胞自發(fā)永生化的幾率非常小，于人類細(xì)胞就更為罕見(jiàn)。

人為干涉讓細(xì)胞永生化的方法包括：放射處理、端粒酶激活、病毒基因轉(zhuǎn)染、原癌基因激活、抑癌基因抑制等。其中，聽(tīng)過(guò)慢病毒感染使細(xì)胞過(guò)表達(dá)猴腎病毒SV40 T抗原或人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT基因，是Z常用的兩種細(xì)胞永生化的方法。

方法A：端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白（TERT）表達(dá)

TERT蛋白是端粒酶的催化亞基，在大多數(shù)體細(xì)胞中通常不活躍。在這種方法中，您可以將編碼人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）蛋白的cDNA插入到您感興趣的原代細(xì)胞中。當(dāng)hTERT被外源性表達(dá)時(shí)，細(xì)胞能夠維持足夠的端粒長(zhǎng)度以避免衰老。這是最近開(kāi)發(fā)用于細(xì)胞永生化的方法。

方法B：病毒致癌基因

病毒致癌基因，如SV40病毒的大T抗原或HPV的E6/E7致癌基因，可以通過(guò)抑制腫瘤抑制基因（例如p53和Rb）來(lái)實(shí)現(xiàn)永生化。這種方法比方法A更快地生效，但可能會(huì)改變一些細(xì)胞的特性。

在許多情況下，單獨(dú)使用方法A和B可能不足以成功實(shí)現(xiàn)永生化。最近的研究發(fā)現(xiàn)，共同表達(dá)hTERT和病毒致癌基因具有更高的成功率，并產(chǎn)生更真實(shí)和正常的細(xì)胞模型，具有明確定義的遺傳背景。

艾美捷永生化細(xì)胞的常見(jiàn)方法：

試劑 機(jī)制 ABM可提供的形式

SV40T Antigen Suppresion of p53 and Rb genes Lentivirus, Adenovirus, Retrovirus

p53 siRNA Knockdown of p53 tumor suppression gene siRNA Lentivirus

Rb siRNA Knockdown of Rb tumor suppression gene siRNA Lentivirus

Ras Suppression of Rb Lentivirus

C-myc T58A Suppression of p53 Lentivirus

Bmi1 Inhibition of p16/Rb pathway Lentivirus

CDK4 Suppression of p16/Rb pathway Lentivirus

HPV 16 E6/E7 Inhibition of p16/Rb pathway Lentivirus

EBV Viral oncogene -

hTERT Elongation of telomeres Lentivirus, Adenovirus, Retrovirus

細(xì)胞系質(zhì)量控制考慮

太好了！在這個(gè)階段，您已經(jīng)生成了一個(gè)永生化細(xì)胞系。但是，在您開(kāi)始在項(xiàng)目中使用您的細(xì)胞系之前，有一些重要的質(zhì)量控制檢查您可以進(jìn)行，以確保您的細(xì)胞系處于wan美狀態(tài)。

A.您的細(xì)胞系表征

每次永生化后，您應(yīng)該始終檢查您的細(xì)胞是否具有適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，以及細(xì)胞的功能，以確保它代表您所使用的原代細(xì)胞。當(dāng)您研究細(xì)胞途徑時(shí)，這一步尤為重要，因?yàn)槟幌Ｍ郎襟E改變了特定途徑、功能或細(xì)胞的表型。 例如，如果您計(jì)劃使用您的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定，那么使用您的永生化細(xì)胞與原代細(xì)胞一起進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定是個(gè)好主意，以確保您新永生化的細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)與它們的原始細(xì)胞相似。

B.傳代和轉(zhuǎn)基因表達(dá)測(cè)試

將您的細(xì)胞傳代至少30次，以證明轉(zhuǎn)基因已穩(wěn)定表達(dá)，并觀察它們的生長(zhǎng)速度已提高，密度能力已增加。

C.STR分析

正如本文開(kāi)頭提到的，驗(yàn)證您的細(xì)胞系身份至關(guān)重要，因?yàn)榭赡軙?huì)發(fā)生交叉污染或種群混合的問(wèn)題。例如，根據(jù)《科學(xué)》雜志上發(fā)表的一篇論文，廣泛用于實(shí)驗(yàn)室的著名HeLa細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)污染了許多細(xì)胞系，包括Hep-2和INT407細(xì)胞系。

識(shí)別細(xì)胞系的黃金標(biāo)準(zhǔn)是短串聯(lián)重復(fù)（STR）分析。STR分析是一種方法，其中在特定位點(diǎn)的短串聯(lián)DNA重復(fù)與標(biāo)準(zhǔn)參考配置文件進(jìn)行比較。細(xì)胞系的STR分析可以用來(lái)確認(rèn)其身份，定期進(jìn)行STR分析是個(gè)好主意，以確保您的細(xì)胞系沒(méi)有隨著時(shí)間的推移受到污染。

為了應(yīng)對(duì)細(xì)胞系誤識(shí)別事件，資助機(jī)構(gòu)如NIH現(xiàn)在要求在資助申請(qǐng)中使用的細(xì)胞系進(jìn)行STR分析，許多期刊也開(kāi)始鼓勵(lì)這個(gè)關(guān)鍵的質(zhì)量控制檢查。

D.支原體和病原體檢測(cè)

最后，始終測(cè)試微生物污染物，如真菌、細(xì)菌和支原體是個(gè)好主意。特別是支原體，是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中Z常見(jiàn)的污染物之一。通常很難通過(guò)顯微鏡下的視覺(jué)檢查來(lái)檢測(cè)支原體。然而，這種細(xì)菌可以影響細(xì)胞的增殖，改變其基因表達(dá)譜，并可能扭曲您的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有許多試劑盒可用，例如abm的PCR支原體檢測(cè)和清除試劑盒，可以輕松檢測(cè)并清除50多種類型的支原體。