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2101程序降溫儀的細(xì)胞凍存操作步驟
2101程序降溫儀的細(xì)胞凍存操作步驟
2101程序降溫儀簡單來說由程序來控制溫度，慢慢的逐步減低保存溫度，以免減溫速度過快，冰晶刺破凍存樣品（如細(xì)胞、胚胎，降溫過快冰晶容易刺破其細(xì)胞壁），從而使得樣品失效。也稱為程控降溫儀、胚胎冷凍儀等等。主要應(yīng)用在精子、細(xì)胞、胚胎等領(lǐng)域的儲存，以及骨髓、造血干細(xì)胞、皮膚、角膜、內(nèi)分泌腺體、以及血管和瓣膜等的冷凍保存。
2101程序降溫儀進(jìn)行細(xì)胞冷凍保存：
1.材料
生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO、無菌塑料冷凍保存管、0.4%(w/v)trypanblue、血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片、2101程序降溫儀。
2.冷凍保存方法
(1)傳統(tǒng)方法：冷存管置于4℃10分鐘>-20℃30分鐘>-80℃16-18小時(或隔夜)>液氮槽長期儲存。-20℃不可超過1小時，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降溫：利用已設(shè)定程序的2101程序降溫儀以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃，再放在液氮槽長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。
3.步驟
(1)冷凍前24-48小時更換半量或全量培養(yǎng)基，使細(xì)胞處于指數(shù)生長期。
(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養(yǎng)基、血清，逐滴加入二甲基亞砜(DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。
(3)離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
(4)取與細(xì)胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液，并晃動試管，制成細(xì)胞凍存懸液(DMSO后濃度為5-10%)，使細(xì)胞濃度為1-5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1-2ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。嚴(yán)密封口后，注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期。然后進(jìn)行凍存。
2101程序降溫儀廣泛用于凍存細(xì)胞、胚胎等。采用微機(jī)控制技術(shù)，軟件，能較準(zhǔn)確地控制液氮的施放量，從而保證被凍存的生物制品以適宜的冷凍速率降溫冷凍。操作簡便、人機(jī)界面清楚。