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Hortic Res：NMT結(jié)合根系轉(zhuǎn)基因技術(shù)快速驗(yàn)證基因功能
NMT作為生命科學(xué)底層核心技術(shù)，是建立活體創(chuàng)新科研平臺(tái)的*技術(shù)。2005年~2020年，NMT已扎根中國(guó)15年。2020年，中國(guó)NMT銷(xiāo)往瑞士蘇黎世大學(xué)，正式打開(kāi)歐洲市場(chǎng)。
基本信息
主題：NMT為磷脂絲胺酸合成酶調(diào)控作物耐鹽提供直接證據(jù)
期刊：Horticulture Research
研究使用平臺(tái)：NMT農(nóng)作物耐鹽創(chuàng)新科研平臺(tái)
標(biāo)題：Overexpression ofphosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasisand salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiportactivity in sweet potato roots
作者：江蘇師范大學(xué)孫健、李宗蕓
檢測(cè)指標(biāo)
Na+、H+、Ca2+
檢測(cè)樣品
甘薯幼苗的轉(zhuǎn)基因根（TRs）以及WT和轉(zhuǎn)基因株系的不定根（ARs）
離子流實(shí)驗(yàn)處理方法
4.1預(yù)處理
① 200 mM NaCl處理24小時(shí)，檢測(cè)TRs和ARs伸長(zhǎng)區(qū)（距根尖1.5、2.0、3.0 mm的根表上的點(diǎn)）和成熟區(qū)（距根尖10、12、15 mm的根表上的點(diǎn)）Na+和H+流速。
② 檢測(cè)WT和轉(zhuǎn)基因株系伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū)在200mMNaCl處理9d的Na+流速。
③ 檢測(cè)150mM NaCl脅迫WT和轉(zhuǎn)基因系根伸長(zhǎng)區(qū)（距根尖2mm的根表上的點(diǎn)）的Ca2+流速。
④ 外源血磷脂酰絲氨酸（LPS）預(yù)處理的WT，在NaCl脅迫48h后，測(cè)定根系伸長(zhǎng)區(qū)Na+流速
⑤ LPS預(yù)處理的WT，在NaCl處理10min后，測(cè)定根伸長(zhǎng)區(qū)（距根尖1.5、2.5和3mm的根表上的點(diǎn)）Ca2+流速。
⑥ LPS預(yù)處理的WT，測(cè)定10mM H2O2處理，根伸長(zhǎng)區(qū)（距根尖1.5、2.5和3mm的根表上的點(diǎn)）Ca2+流速。
4.2瞬時(shí)處理
①150 mM NaCl和10 mM H2O2瞬時(shí)處理 TRs和ARs伸長(zhǎng)區(qū)（距2 mm的根表上的點(diǎn)）記錄Ca2+流速。
②10mM H2O2瞬時(shí)處理WT和轉(zhuǎn)基因植株根伸長(zhǎng)區(qū)（距2 mm的根表上的點(diǎn)）記錄Ca2+流速
K+流Ca2+流結(jié)果
5.1 IbPSS1過(guò)表達(dá)甘薯根系細(xì)胞Na+穩(wěn)態(tài)改變
在NaCl（200mM）脅迫24h后，ARs和TRs的所有被測(cè)根區(qū)（伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū)）都顯示出明顯的Na+外排（圖1A），而在TRs中觀察到比ARs更明顯的Na+外排。TRs兩個(gè)根區(qū)的平均Na+外排速率分別比ARs高2.5倍和2.3倍（圖1A、B）。相應(yīng)地，在ARs和TRs的兩個(gè)根區(qū)記錄到明顯的H+內(nèi)流（圖1C）。與Na+外排相似，TRs兩個(gè)根區(qū)的H+內(nèi)流明顯高于ARs（圖1D）。在沒(méi)有NaCl脅迫的情況下，ARs和TRs之間沒(méi)有觀察到Na+或H+流速的差異（數(shù)據(jù)未展示）。這些結(jié)果表明，IbPSS1過(guò)表達(dá)通過(guò)激活PM-Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體活性來(lái)抑制細(xì)胞Na+的積累。
圖1
5.2 IbPSS1在甘薯根中的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了PM-Ca2+通道對(duì)NaCl和H2O2的敏感性
為了研究IbPSS1對(duì)鹽漬甘薯根系Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，我們測(cè)定了NaCl誘導(dǎo)的瞬時(shí)Ca2+流速。NaCl（150mM）在ARs的伸長(zhǎng)區(qū)誘導(dǎo)了一個(gè)瞬時(shí)且逐漸減少的Ca2+外排，在NaCl處理20min后恢復(fù)到對(duì)照水平（圖2A）。我們沒(méi)有觀察到鹽脅迫下ARs中Ca2+內(nèi)流明顯增加。然而，NaCl誘導(dǎo)TRs伸長(zhǎng)區(qū)的Ca2+外排量遠(yuǎn)低于ARs（圖2A）。在TRs中，我們觀察到添加NaCl后，從0分鐘到10分鐘，NaCl誘導(dǎo)的Ca2+外排逐漸減少，并且在NaCl處理10分鐘后，Ca2+流出明顯轉(zhuǎn)變?yōu)镃a2+內(nèi)流（圖2A）。這些結(jié)果清楚地表明IbPSS1的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了甘薯根PM- Ca2+通道對(duì)NaCl脅迫的敏感性。
我們進(jìn)一步比較了H2O2誘導(dǎo)的ARs和TRs伸長(zhǎng)區(qū)的Ca2+流速。H2O2（10mM）誘導(dǎo)了ARs中Ca2+的立即內(nèi)流。H2O2處理下的平均Ca2+內(nèi)流速率達(dá)到23 pmol cm-2 s-1（圖2B）。H2O2誘導(dǎo)TRs伸長(zhǎng)區(qū)Ca2+內(nèi)流較ARs明顯。TRs中的平均Ca2+內(nèi)流率達(dá)到60 pmol cm-2 s-1（圖2B）。這些結(jié)果表明，在TRs中PM-Ca2+通道對(duì)H2O2的敏感性也增強(qiáng)。
圖2
5.3IbPSS1過(guò)表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因甘薯的耐鹽性
為了確定IbPSS1是否能在整個(gè)植株水平上提高耐鹽性，三個(gè)具有多bPSS1轉(zhuǎn)錄水平的再生轉(zhuǎn)基因系（L11、L17和L19）被用于進(jìn)一步的生理特性鑒定。對(duì)WT和IbPSS1轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行NaCl（200mM）處理9天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個(gè)轉(zhuǎn)基因品系鹽漬根的伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū)的Na+凈外排量顯著高于野生型（圖3G）。此外，在IbPSS1高表達(dá)幼苗的根部，PM-Ca2+滲透通道對(duì)NaCl和H2O2的敏感性增強(qiáng)（圖3H，J）。
在NaCl（200mM）脅迫48h后，LPS預(yù)處理的WT根系伸長(zhǎng)區(qū)Na+外排量比未處理的增加了65%（圖3C）。此外，由NaCl脅迫（150mM；在NaCl處理10 min后開(kāi)始測(cè)量Ca2+流速；圖3D）和H2O2（10 mM；H2O2處理后立即開(kāi)始測(cè)量Ca2+流速；圖3E）誘導(dǎo)的平均Ca2+內(nèi)流速率在LPS預(yù)處理的根中比未處理的根增強(qiáng)更多。
圖3
其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果
IbPSS1參與了磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）的合成。
高效甘薯根系轉(zhuǎn)基因體系可以有效地用于確定相關(guān)基因在介導(dǎo)甘薯根系Na+穩(wěn)態(tài)中的作用。
IbPSS1過(guò)表達(dá)在全株水平上提高了轉(zhuǎn)基因甘薯的耐鹽性
結(jié)論
IbPSS1通過(guò)促進(jìn)根系Na+穩(wěn)態(tài)和Na+外排來(lái)增強(qiáng)甘薯的耐鹽性，而后一過(guò)程可能是通過(guò)PS增強(qiáng)根內(nèi)Ca2+信號(hào)來(lái)控制的。
離子流實(shí)驗(yàn)使用的測(cè)試液
0.5 mM NaCl，0.1 CaCl2，pH 6.0