簡介

在藥物開發(fā)過程的早期了解其對心臟系統(tǒng)的影響對于提高上市藥物的安全性非常重要。心臟毒性被認(rèn)為是臨床前和臨床試驗(yàn)期間藥物流失的主要原因之一1，2。此外，環(huán)境化學(xué)暴露是心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素，但許多環(huán)境因素的毒理學(xué)作用仍未得到充分的檢測3。

人iPSC源性心肌細(xì)胞類似于原代心臟細(xì)胞的表型和功能，并可以避免使用原代細(xì)胞所帶來的變異性。iPSC源性心肌細(xì)胞表現(xiàn)出同步的自發(fā)性收縮，可以被藥物和化合物進(jìn)行修飾，使其成為生物學(xué)相關(guān)模型。雖然可以在透射光下記錄機(jī)械性收縮，但也有研究表明，使用Ca2+ 敏感熒光染料觀察到的鈣振蕩模式紊亂可用于測量對心肌細(xì)胞搏動(dòng)率和模式的影響5，6。之前的應(yīng)用文章中描述了使用ImageXpress® Micro高內(nèi)涵成像系統(tǒng)在iPSC 源性心肌細(xì)胞中進(jìn)行延時(shí)成像，記錄和分析鈣振蕩的方法4-6。

這篇應(yīng)用文章展示了MetaXpress分析工具用于觀察和分析2D和3D心肌細(xì)胞樣品中Ca2+振蕩信號軌跡的實(shí)用性。我們描述了熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的生成，突出了在iPSC源性心肌細(xì)胞球上運(yùn)行的目標(biāo)物強(qiáng)度通量分析。此外，我們總結(jié)了生成多參數(shù)峰值讀數(shù)的步驟，包括拍攝頻率、峰值寬度、振幅和規(guī)律性。

Materials

•       iCell心肌細(xì)胞2 （FUJIFILM Cellular Dynamics Inc.）

•       iCell心肌細(xì)胞平板培養(yǎng)基 （FUJIFILM Cellular Dynamics Inc.）

•       iCell心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基（FUJIFILM Cellular Dynamics Inc.）

•       384孔微孔板（Corning,cat. # 3712）

•       384 孔、低吸附、U型微孔板（Corning,cat. #3830）

•       0.1% 明膠（Sigma, St. Louis, MO）

•       EarlyTox心臟毒性試劑盒或鈣6染料 （Molecular Devices）

•       采用ImageXpress Micro Confocal共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)和6.5版本MetaXpress®圖像采集分析軟件（Molecular Devices）

優(yōu)勢

•       記錄2D和3D心肌細(xì)胞樣品中的Ca2+振蕩

• 分析復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)模式

• 測量熒光隨時(shí)間推移的波動(dòng)

• 生成多參數(shù)峰值數(shù)據(jù)

• 在高密度微孔板中篩選化合物對心臟功能的復(fù)合效應(yīng)

方法

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案，以2D或3D檢測形式培養(yǎng)人iPSC源性心肌細(xì)胞。對于傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)，將細(xì)胞以7，000 個(gè)細(xì)胞/孔接種到384孔微孔板的明膠包被中。對于3D培養(yǎng)形式，將5，000個(gè)細(xì)胞在明膠的存在下接種到低附著U形384孔微孔板中。接種后4至5天，用已知有心臟活性和心臟毒性的化合物處理心肌細(xì)胞，濃度范圍為100µM-0.3 µM，持續(xù)1小時(shí)、24小時(shí)和5天6。然后使用EarlyTox心毒性檢測試劑盒或鈣6染料對心肌細(xì)胞進(jìn)行染色，這兩種試劑盒均可檢測心肌細(xì)胞收縮的動(dòng)力學(xué)指標(biāo)——細(xì)胞質(zhì)中鈣水平的變化。將延時(shí)成像程序設(shè)置為3-10 ms的曝光時(shí)間、0.1-0.3秒的時(shí)間間隔、60-100個(gè)總時(shí)間點(diǎn)，在一個(gè)孔中采集整個(gè)時(shí)間序列，然后采集下一個(gè)孔6。此快速動(dòng)力學(xué)成像在ImageXpress Micro Confocal細(xì)胞成像系統(tǒng)中以寬場模式進(jìn)行采集（10X物鏡、FITC通道）。

MetaXpress軟件中的Journal可用于自動(dòng)化自定義圖像采集、圖像處理和圖像分析工作流程。
使用Journal（Object Intensity Flux）只需點(diǎn)擊一次即可運(yùn)行和分析各種細(xì)胞和檢測類型的振蕩行為，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物并對其進(jìn)行熒光強(qiáng)度振蕩分析。圖 1B 顯示了該分析的心球圖像。該方法可以測量圖像熒光或明場強(qiáng)度隨時(shí)間推移的重新分布。圖1B顯示了心肌細(xì)胞的分析圖像。選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)化選項(xiàng)后，可用此方法對透射光下捕獲的心肌細(xì)胞的無標(biāo)記記錄以及熒光樣本記錄進(jìn)行分析。圖1B顯示了2D心肌細(xì)胞圖像的強(qiáng)度變化分析。熒光強(qiáng)度和閾值百分比數(shù)據(jù)被繪制成圖表并用于下游Ca2+振蕩（表示心跳）的多參數(shù)計(jì)算（圖2和3）6。

圖 1：細(xì)胞球和2D心肌細(xì)胞Ca2+振蕩圖的示意圖。 使用鈣6染料染色的細(xì)胞球和2DiPSC 源性心肌細(xì)胞的延時(shí)圖像。（A）目標(biāo)物強(qiáng)度通量分析利用最大熒光強(qiáng)度的圖像來創(chuàng)建分割掩膜。該分割應(yīng)用于給定細(xì)胞球的整個(gè)時(shí)間點(diǎn)圖像集合，以測量熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。（B）強(qiáng)度變化分析可測量熒光信號隨時(shí)間的重新分布，并生成百分比閾值和平均熒光強(qiáng)度測量值。

圖像分析

測定2D 和3D心肌細(xì)胞樣品單平面圖像
細(xì)胞隨時(shí)間推移的熒光強(qiáng)度波動(dòng)以分析心臟細(xì)胞搏動(dòng)

本應(yīng)用手冊中，我們在ImageXpress Micro Confocal系統(tǒng)中以0.2 秒的時(shí)間間隔對iPSC源性心肌細(xì)胞的細(xì)胞球進(jìn)行共60 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的成像，并使用MetaXpress軟件中的Object IntensityFlux進(jìn)行分析。該分析可以從時(shí)間點(diǎn)圖像集合中識別最大強(qiáng)度的細(xì)胞球圖像，并使用該閾值來分割細(xì)胞球。該分割應(yīng)用于給定孔的整個(gè)時(shí)間點(diǎn)圖像集合，以測量平均熒光強(qiáng)度（圖 1）。

數(shù)據(jù)分析

使用峰值分析軌跡生成多個(gè)參數(shù)

通過繪制平均熒光強(qiáng)度與MetaXpress軟件中時(shí)間的曲線，以觀察化合物處理后細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 的表型反應(yīng)。圖2展示的振蕩強(qiáng)度圖可以被用于優(yōu)化峰值分析設(shè)置（圖 3A），以最佳方式表示軌跡。如果細(xì)胞熒光強(qiáng)度存在孔間變化，可以針對不同孔中峰值之間的振幅和斜率閾值變化，選擇動(dòng)態(tài)閾值功能進(jìn)行調(diào)整（圖 3A）。確保為所有孔準(zhǔn)確找到峰值。SmoothWidth值是指用于平滑峰值數(shù)據(jù)的點(diǎn)數(shù)，應(yīng)足夠高，以平滑峰值檢測的噪聲。過高的值最終將出現(xiàn)在未計(jì)數(shù)的實(shí)際峰值中，而過低的值則可能將噪聲峰值視為峰值。

圖 2. 心臟毒性化合物的代表性鈣流信號軌跡（平均熒光強(qiáng)度）。 所示跡線是典型的表型反應(yīng)，包括未受影響的常規(guī)Ca2+通量（DMSO對照）模式，以及受影響的阿司咪唑、舒尼替尼、利培多、西沙必利等模式。這些跡線代表處理24小時(shí)后心肌細(xì)胞球的反應(yīng)。

MetaXpress峰分析工具生成的測量值可以輕松導(dǎo)出為表格或文本文件。測量結(jié)果包括搏動(dòng)率、峰值振幅、峰值寬度、上升和衰減時(shí)間以及規(guī)律性，可深入觀察化合物處理后心臟搏動(dòng)率和模式的變化（圖 3B）。

圖 3. 使用MetaXpress峰值分析法分析鈣流信號軌跡（平均熒光強(qiáng)度）。（A）用戶界面設(shè)置和計(jì)算讀數(shù)的截圖。設(shè)置平滑寬度和擬合寬度，以最好地顯示心臟搏動(dòng)圖中的軌跡。（B）與峰相關(guān)的峰分析測量值。

結(jié)論

MetaXpress軟件6.5版本及更高版本具備記錄和分析復(fù)雜動(dòng)力學(xué)模式包括代表細(xì)胞收縮的鈣振蕩的能力。使用ImageXpress Micro系統(tǒng)對2D 和3D心肌細(xì)胞培養(yǎng)物中的Ca2+ 振蕩進(jìn)行快速動(dòng)力學(xué)熒光成像，并使用MetaXpress峰分析工具進(jìn)行分析，能夠?qū)Ω呙芏任⒖装逯械男呐K功能進(jìn)行化合物篩選和研究。該一體化軟件可無縫結(jié)合成像、分析、生成圖表和數(shù)據(jù)，從而提供未經(jīng)處理和已處理樣品中心臟搏動(dòng)特征的完整視圖，以便對候選藥物進(jìn)行早期鑒定或評估由環(huán)境因素引起的心臟毒性作用。

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