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科研新手必看！RNA甲基化整體水平鑒定的方法匯總
RNA甲基化（RNA methylation）是一類表觀遺傳修飾，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的超過(guò)100種不同的RNA化學(xué)修飾中，主要有6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）、5-甲基胞嘧啶（C5-methylcytidine, m5C）和1-甲基腺嘌呤（N1-methyladenosine, m1A）。RNA 甲基化在調(diào)控基因表達(dá)、編輯、穩(wěn)定性及降解等方面扮演重要角色。早在20世紀(jì)70年代，人們已經(jīng)在真核生物的mRNA和lncRNA中發(fā)現(xiàn)了m6A修飾。但受制于技術(shù)的局限性，無(wú)法開(kāi)展m6A檢測(cè)尤其是m6A定量分析，甚至是單堿基水平m6A的鑒定。隨著高通量測(cè)序技術(shù)（NGS）的發(fā)展以及液相色譜靈敏度的提高，RNA甲基化整體水平的鑒定方法得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。
目前RNA甲基化整體水平的鑒定所用的技術(shù)手段包括液相色譜聯(lián)用（LC-MS）、比色法以及Dot blotting等。下面就分別來(lái)介紹目前較為流行的RNA甲基化整體水平的鑒定方法。
1. LC-MS/MS
LC-MS/MS在液相質(zhì)譜的基礎(chǔ)上采用串聯(lián)質(zhì)譜，能夠獲得分子離子峰和碎片離子峰，可對(duì)堿基同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析。第yi步使用TRIzol提取完Total RNA后，對(duì)mRNA進(jìn)行富集并去除rRNA。第二步是在37℃條件下，將200-300 ng mRNA用含有25 mM NaCl和2.5 mM ZnCl2緩沖液的核酸酶P1（2 U）消化2 h，然后加入NH4HCO3（1 M，3 μl）和堿性磷酸酶（0.5 U），37℃再孵育2 h后，將RNA從單鏈消化成單個(gè)堿基。第三步將樣品稀釋至50 μl并過(guò)濾，并將5 μl溶液注入LC-MS/MS中，根據(jù)出峰的保留時(shí)間面積計(jì)算各個(gè)堿基的含量。第四步進(jìn)入質(zhì)譜串聯(lián)分析，單個(gè)核糖核苷酸會(huì)被離子化，同時(shí)被打斷成五碳糖和嘧啶或嘌呤，在C18柱上通過(guò)反相超高效液相色譜分離核苷，使用Agilent 6410 QQQ三重四極桿LC質(zhì)譜儀以正電噴霧電離模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，根據(jù)出峰的保留時(shí)間計(jì)算m6A的面積。后根據(jù)m6A和總A的比例就能算出m6A在mRNA上整體的甲基化程度。
2. 比色法
比色法RNA甲基化整體水平鑒定也是我們?cè)菩蛏锏囊豢町a(chǎn)品。相對(duì)于LC-MS/MS較為繁瑣的操作，比色法更為簡(jiǎn)便。m6A定量檢測(cè)試劑盒（比色法）提供了所有定量檢測(cè)總RNA中m6A試劑。在這個(gè)分析試劑盒中，采用類似于ELISA抑制競(jìng)爭(zhēng)免疫的方法，樣本和m6A標(biāo)準(zhǔn)品*與m6A抗體溶液被孵育；然后轉(zhuǎn)移到包被有m6A多核苷酸的條孔上。在孵育之后孔可以洗脫任何未包被的試劑然后添加檢測(cè)抗體生成信號(hào)，通過(guò)微孔板讀取儀（如：酶標(biāo)儀）來(lái)檢測(cè)。因?yàn)樵跇颖镜膍6A抑制了m6A抗體與涂抹在孔上m6A的結(jié)合，樣本中更高濃度導(dǎo)致與在孔中的m6A結(jié)合減少。因此，從孔總測(cè)的信號(hào)或OD參數(shù)與樣本中m6A的數(shù)量成反比。并且樣本中m6A的量可以通過(guò)預(yù)先設(shè)定的m6A標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
3. 熒光法
m6A RNA甲基化定量檢測(cè)試劑盒（熒光法）提供了所有定量檢測(cè)總RNA中m6A的必要試劑。在這個(gè)分析試劑盒中，使用高效RNA結(jié)合液將總RNA綁定在孔板上。使用捕獲和檢測(cè)抗體對(duì)m6A進(jìn)行檢測(cè)。隨著信號(hào)的增強(qiáng)然后使用熒光分光光度計(jì)讀取RFU（relative fluorescence units）吸光值。m6A的量與測(cè)量的熒光單位成比例。
4. Dot blotting
與其他方法相比，如二維薄層色譜和LC-MS/MS等，使用Dot blotting檢測(cè)mRNA中m6A甲基化總體水平的方法相對(duì)簡(jiǎn)單、快速且成本較低。第yi步是總RNA的提取，使用Dynabeads® mRNA Purification Kit分離出mRNA，采用NanoDrop方法檢測(cè)mRNA的純度，并稀釋成不同的濃度。第二步Dot blotting，在95℃的高溫下將連續(xù)稀釋的mRNA變性。在變性后立即冷卻，以防止mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的重新形成。將2 μl的mRNA直接轉(zhuǎn)移至經(jīng)核酸優(yōu)化的尼龍薄膜上。在特定條件下進(jìn)行自動(dòng)交聯(lián)，采用溫和的方式洗去未結(jié)合的mRNA并過(guò)濾。在4℃、溫和震蕩的條件下，用抗m6A的抗體10 ml稀釋緩沖液孵育薄膜。在溫和震蕩的條件下，用10 ml的洗滌緩沖液對(duì)薄膜清洗3次，每次5 min。用羊抗兔IgG-HRP（1:10000稀釋，20 ng/ml）在室溫下孵育尼龍薄膜。用10 ml的洗滌緩沖液洗滌薄膜，每10 min清洗一次，每次清洗10min。在黑暗室溫下，使用3 ml的Western Blotting Substrate孵育尼龍薄膜。封膜處理后，用超薄膜ECL進(jìn)行曝光，以獲得適當(dāng)?shù)钠毓鈺r(shí)間，后顯影觀察。