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急性髓系白血病(AML)作為惡性程度最高的血液腫瘤之一,其對(duì)傳統(tǒng)化療及免疫治療的耐藥性問題長期困擾臨床。近年研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞通過劫持免疫檢查點(diǎn)分子實(shí)現(xiàn)"免疫逃逸",但針對(duì)AML的特異性免疫抑制機(jī)制仍存在巨大認(rèn)知盲區(qū)。本研究首-次揭示,LILRB4/APOE信號(hào)軸通過重構(gòu)腫瘤微環(huán)境,形成"免疫沉默-代謝重編程"雙重防御體系,為AML精準(zhǔn)治療開辟全新路徑。
本研究首-次揭示LILRB4通過"配體-受體-信號(hào)-效應(yīng)"四層架構(gòu)調(diào)控AML免疫逃逸與轉(zhuǎn)移,提出"免疫抑制-代謝重編程"雙軌機(jī)制假說。靶向LILRB4的抗體療法在臨床前模型中展現(xiàn)出高效低毒特性,為單核細(xì)胞AML精準(zhǔn)治療提供新策略。相關(guān)成果已申請(qǐng)國際專-利(PCT/US2016/020838),并與Immune-Onc Therapeutics公司達(dá)成轉(zhuǎn)化合作。
研究方法
1. 臨床樣本分析
利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析LILRB4 mRNA表達(dá)水平與AML患者預(yù)后的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)與生存期縮短顯著相關(guān)。
流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證LILRB4在單核細(xì)胞AML(FAB M4/M5亞型)中特異性高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面,且高于正常單核細(xì)胞。
2. 功能驗(yàn)證
體外實(shí)驗(yàn):通過CRISPR/Cas9構(gòu)建LILRB4敲除細(xì)胞系(lilrb4-KO),結(jié)合野生型(WT)及回補(bǔ)細(xì)胞(lilrb4-KO-wt),利用Transwell共培養(yǎng)體系評(píng)估T細(xì)胞增殖抑制能力。
體內(nèi)模型:建立人源化免疫缺陷小鼠(NSG)及同源小鼠(C57BL/6)異種移植模型,通過皮下注射或靜脈移植LILRB4敲除/過表達(dá)的AML細(xì)胞,監(jiān)測(cè)腫瘤生長及T細(xì)胞浸潤情況。
3. 機(jī)制解析
配體鑒定:通過蛋白液相色譜(FPLC)、質(zhì)譜(MS)及表面等離子共振(SPR)技術(shù)篩選并驗(yàn)證APOE為LILRB4特異性配體,結(jié)合常數(shù)(KD)為210 nM。
信號(hào)通路分析:采用Western blot、免疫沉淀(Co-IP)及RNA測(cè)序(RNA-seq)探究下游信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)LILRB4通過SHP-2磷酸化激活NF-κB通路,誘導(dǎo)uPAR及ARG1表達(dá)。
功能挽救實(shí)驗(yàn):通過外源性補(bǔ)充APOE、uPAR或ARG1,驗(yàn)證其對(duì)T細(xì)胞抑制及腫瘤浸潤的調(diào)控作用。
研究結(jié)果
1. LILRB4表達(dá)與AML預(yù)后及免疫抑制密切相關(guān)
TCGA數(shù)據(jù)顯示,LILRB4高表達(dá)組患者總生存期顯著縮短(HR=2.34, p=0.0003),且其表達(dá)水平與T細(xì)胞耗竭標(biāo)志物(PD-1、TIM-3)呈正相關(guān)。
體外共培養(yǎng)證實(shí),LILRB4+ AML細(xì)胞通過胞內(nèi)段傳遞抑制信號(hào),顯著降低CD8+ T細(xì)胞增殖及IFN-γ分泌能力。
2. LILRB4通過APOE介導(dǎo)的信號(hào)軸調(diào)控T細(xì)胞抑制與腫瘤浸潤
配體結(jié)合:APOE通過其N端結(jié)構(gòu)域與LILRB4的Ig樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合,激活下游SHP-2磷酸化(p-Y580),進(jìn)而促進(jìn)NF-κB入核,上調(diào)uPAR及ARG1表達(dá)。
功能依賴性:LILRB4敲除顯著抑制THP-1細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移能力(p<0.01),而APOE或uPAR回補(bǔ)可部分恢復(fù)其侵襲表型。
3. 靶向LILRB4的治療潛力
體內(nèi)驗(yàn)證:抗LILRB4抗體(Fc工程化改造以降低ADCC效應(yīng))顯著抑制AML異種移植瘤生長(腫瘤體積減少67%,p<0.001),并延長荷瘤小鼠生存期(中位生存期從28天延長至45天)。
免疫重塑:抗體治療促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中CD8+ T細(xì)胞浸潤(浸潤指數(shù)↑3.2倍),并增強(qiáng)其殺傷活性(顆粒酶B+ T細(xì)胞比例↑40%)。
安全性評(píng)估:正常造血干細(xì)胞(CD34+)表面LILRB4表達(dá)極低(MFI=12±3 vs. AML細(xì)胞MFI=120±15),抗體處理未影響人源化小鼠骨髓重建效率。
ATHENS為本研究所提供的產(chǎn)品
Athens Research & Biotechnology為本研究提供了多種APO家族蛋白(尤其是重組人APOE),直接支持了LILRB4配體篩選、信號(hào)通路解析及功能驗(yàn)證,是揭示“APOE/LILRB4軸"在白血病免疫逃逸中作用的關(guān)鍵合作伙伴。
具體產(chǎn)品:
APOA1
APOA2
APOA4
APOB
APOC1
APOC2
APOC3
hAPOE
功能用途:
作為候選配體,通過 蛋白液相色譜(FPLC) 和 表面等離子共振(SPR) 篩選,驗(yàn)證其與 LILRB4 的結(jié)合能力。
用于 體外實(shí)驗(yàn) 中模擬生理?xiàng)l件下APOE對(duì)LILRB4的激活作用,證明其通過特定結(jié)構(gòu)域(如Ig樣結(jié)構(gòu)域)與LILRB4相互作用。
關(guān)于ATHENS
Athens Research & Technology公司(ART),自1986年成立以來,已近40年專注于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)天然蛋白質(zhì),致力于為體外診斷(IVD)行業(yè)及研究人員提供高純度、高活性的產(chǎn)品。我們的制造流程嚴(yán)格,質(zhì)量承諾值得信賴,確??蛻裟軌蛞蕾囄覀兊牡鞍踪|(zhì)開發(fā)可靠、準(zhǔn)確的診斷試劑,滿足當(dāng)今醫(yī)療保健的迫切需求。
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