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亮發(fā)光桿菌的冷凍干燥保藏操作說明

1.冷凍干燥管的選擇與清洗

冷凍干燥管一般采用耐溫度驟變，耐壓，管壁厚度均一并且為中性玻璃的安瓿管。管的內(nèi)徑為8mm左右，長度不小于100mm：

清洗安瓿管時(shí)，先用2％鹽酸浸泡，然后用自來水沖洗3次以上，zui后用蒸餾水沖洗、浸泡至pH中性，然后干燥。

2.標(biāo)簽的準(zhǔn)備

菌種的標(biāo)記方法有很多種，一般分為管外側(cè)標(biāo)記和管內(nèi)標(biāo)記兩種。

管外側(cè)標(biāo)記常用以下兩種方式：

(1)采用標(biāo)簽機(jī)在大小為1cm×3cm左右的標(biāo)簽上打印菌種編號(hào)、保藏日期，然后貼在安瓿管外。

(2)將膠布剪成大約1 cm寬，3～4cm長的小條，在上面填寫菌種編號(hào)、保藏日期，然后貼在安瓿管外：使用碳素鉛筆標(biāo)記。

管內(nèi)標(biāo)記法：選擇濾紙或吸水紙(大小為1 cm×3cm)記錄菌種的編號(hào)、保藏日期，滅菌后裝入冷凍干燥后的安瓿管內(nèi)。

3.保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備

保護(hù)劑可以減少冷凍干燥引起的微生物細(xì)胞的損傷。保護(hù)劑的選擇與配制因所保藏的菌種的不同有所變化。配制保護(hù)劑時(shí)，應(yīng)注意保護(hù)劑材料的搭配、保護(hù)劑的濃度以及pH值(一般保持中性)。常用的保護(hù)劑為脫脂乳。一般微生物保存常用的保護(hù)劑參見附錄B《常用保護(hù)劑》。厭氧微生物冷凍干燥所用的保護(hù)劑在使用前應(yīng)在100℃的沸水中煮沸15min左右，脫氣后放入冷水中急冷，以除掉保護(hù)劑中的溶解氧。

4.分裝與加棉塞

分裝菌液應(yīng)在無菌條件下操作。采用較長的滴管，直接將菌液滴人安瓿管或凍存管底部．注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0．1～0．2ml。若是球形安瓿管，裝量為半個(gè)球部。一般2～2 5ml菌液可以分裝10～15個(gè)安瓿管。分裝后用脫脂棉堵住安瓿管管口，注意不要過緊或過松。分裝時(shí)間盡量要短，在1—2h內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。

5.預(yù)凍

不同保護(hù)劑的共晶點(diǎn)溫度不同，預(yù)凍溫度應(yīng)低于共晶點(diǎn)溫度10℃左右。

目前，常用降溫方法有以下3種：

(1)程序控溫降溫法。應(yīng)用程序控制降溫儀，可以穩(wěn)定連續(xù)降溫，能很好地控制降溫速率；

(2)冷凍干燥機(jī)自行冷凍。某些冷凍干燥機(jī)具有冷凍功能，在真空泵不開啟的情況下，可將菌種冷凍到一40℃左右；

(3)將菌種放入一80℃冰箱預(yù)凍：預(yù)凍速度控制在每分鐘下降1℃、使樣品凍結(jié)到一35～一40℃。

6.冷凍干燥

采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。

將預(yù)凍后的樣品安瓿管迅速置于已充分預(yù)冷的冷凍干燥機(jī)樣品艙內(nèi)，關(guān)閉放氣閥，打開真空泵開始冷凍干燥，接近干燥完成時(shí)，適當(dāng)升溫(按冷凍干燥機(jī)的具體要求進(jìn)行操作)，確認(rèn)冷凍干燥完畢后，緩慢打開放氣閥，取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi)，備用。

判斷冷凍干燥已*的指標(biāo)：

·安瓿管內(nèi)凍干物呈酥松塊狀或松散片狀；

．冷凍干燥機(jī)顯示的樣品溫度與艙內(nèi)溫度接近；

．蒸餾水對照管中的水分已*揮發(fā)掉或1％-2％氯化鈷的對照管已呈深藍(lán)色。

7.安瓿管封口及真空檢驗(yàn)

從干燥器中取出冷凍干燥*的安瓿管，在距管口5cm左右用噴射火焰(噴燈、焊槍等)將安瓿管托細(xì)，然后將安瓿管口連接到與真空安瓿管泵相連的橡皮管上，打開真空泵，在真空條件下(一般真空度達(dá)到0.001托)，用噴射火焰對準(zhǔn)安瓿管*部加熱熔封。

熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀檢測真空度。

8.保藏

封口*的冷凍干燥管應(yīng)低溫避光保藏。

9.質(zhì)量檢查

一般在封口后ld、7d、30d隨機(jī)抽取若干支冷凍干燥管進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢查，例如，存活率、能力、形態(tài)變異、雜菌污染等?？蓞⒁妵易匀豢萍假Y源平臺(tái)制定的《微生物菌種純度檢測技術(shù)規(guī)程(試行)》。

10.冷凍干燥法適用范圍

適用于大多數(shù)細(xì)菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、部分絲狀真菌和酵母等的保藏，但不適用于藻類和原蟲等的保藏。

11.保藏周期

不同微生物的保藏周期不同，一般在10年左右。

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