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貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞免疫熒光染色方法

閱讀:2159      發(fā)布時(shí)間:2021-6-7
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  【步驟】(以間接免疫熒光法為例)
 
  1  細(xì)胞準(zhǔn)備與固定
 
  (1)單層生長細(xì)胞:取對(duì)數(shù)生長細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化,制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種到預(yù)先放置幾張6×22mm蓋玻片的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中,置二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-3天,待細(xì)胞接近長成單層,取出蓋玻片,進(jìn)入PBS(0.01 mol/L,pH7.4)洗2次,然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,選擇適當(dāng)固定劑固定細(xì)胞。常用固定劑有:95%乙醇(固定時(shí)間10-30min),丙酮(5-10min)等。
 
  (2) 懸浮生長細(xì)胞:取對(duì)數(shù)生長細(xì)胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,或用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片,把細(xì)胞片浸入95%乙醇或丙酮中固定。
 
  2  將已經(jīng)固定的細(xì)胞玻片放入蓋片染色缸,用PBS振洗5min,取出吹干。
 
  3  滴加適當(dāng)稀釋的特異性抗體,置于濕盒內(nèi),37度保溫30-60min或度冰箱過夜。
 
  4  PBS振洗3次,每次5min,吹干。
 
  5  滴加適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記抗體,置于濕盒內(nèi),37度保溫30-60min。
 
  6  PBS振洗2次,每次5min,然后用蒸餾水振洗1次。
 
  7  50%緩沖甘油封片。
 
  【結(jié)果】
 
  在熒光顯微鏡下觀察,陽性部位出現(xiàn)熒光,依熒光素種類不同呈現(xiàn)不同顏色的熒光,入FITC呈現(xiàn)黃綠色熒光,羅丹明B200呈現(xiàn)橙紅色熒光。
 
  標(biāo)本染色反應(yīng)后應(yīng)及時(shí)觀察并照相。若無時(shí)間立即觀察標(biāo)本,可把標(biāo)本放入4度冰箱保存。但應(yīng)注意,過夜后特異性熒光減弱30%,一周后則減弱50%。如果用聚乙烯醇封片,可保存較長時(shí)間。

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