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上海希言科學(xué)儀器有限公司

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流式細胞儀檢測技術(shù)實驗

閱讀:2701      發(fā)布時間:2018-6-29
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流式細胞儀(flow cytometer)是一種能夠探測和計數(shù)以單細胞液體流形式穿過激光束的細胞檢測裝置,由于在檢測中使用的細胞標(biāo)志示蹤物質(zhì)為熒光標(biāo)記物,因此,用來分離、鑒定細胞的流式細胞儀有被稱為熒光激活細胞分類儀,是分離和鑒定細胞群及亞群的一種強而有力的應(yīng)用工具。

  • 流式細胞儀
實驗方法原理

流式細胞儀的使用一般分為三個步驟。,是儀器前階段,包括試劑的準備,細胞制備、細胞的熒光染色;第二,是流式細胞儀階段,主要是儀器的操作;第三,是結(jié)果分析階段。

實驗材料

淋巴細胞外周血的白細胞

試劑、試劑盒

FACS緩沖液PBS疊氮鈉溶液儀器緩沖液FACS清潔液FACS洗凈液

儀器、耗材

流式細胞儀

實驗步驟

一、 細胞和試劑的準備


1.  細胞樣品:來源淋巴細胞或外周血的白細胞。


2.  熒光標(biāo)記單克隆抗體:常用的有FITC(fluorescein -isothiocyanate)和PE(phycoerythrin)標(biāo)記的單克隆抗體。


3.  封閉抗體:抗Fc受體抗體

 

4.  FACS緩沖液:

1×PBS  950 ml

FCS  40 ml

10%疊氮鈉溶液  10 ml


5.  儀器緩沖液(FACS-flow):儀器廠家提供


6.  FACS清潔液(FACS clean )和FACS洗凈液(FACS rinse):儀器廠家提供。


二、操作步驟
 

1.  單細胞懸液的制備:將1×105~1×107的細胞放入1.5 m l離心管中3000 r/min 離心5分鐘,棄上清;加入FACS緩沖液100 μl 懸浮細胞。


2.  封閉細胞表面Fc受體:在步驟1中加入Fc受體抗體0.5 μl(0.5 mg/ml),水浴3分鐘。


3.  細胞與熒光抗體結(jié)合:在步驟2中加入熒光抗體1 μl(0.5 mg/ml),水浴30分鐘。


4.  洗細胞去除游離的熒光抗體:在步驟3中加入FACS緩沖液350 μl,輕輕混勻,3000 r/min,離心5分鐘,棄上清,重復(fù)步驟(4)2次。


5.  上樣前處理:取100 μl 儀器緩沖液加入步驟(4)獲得的細胞沉淀中,輕輕混勻懸浮細胞,將細胞懸液移入FACS管中,準備進行儀器檢測和分析。


三、儀器的操作


以FACSCaliburTM(BD Biosciences)儀器為例。儀器主要分為主機部分(包括激光激活源,射流,射線探測器)和計算機部分(CELLQuest softwere)。儀器的操作分為使用前的準備、使用中的操作和使用后的清洗。


1.使用前的準備


(1)打開電源:包括系統(tǒng)電源和主機部分電源。


(2)檢查供液槽和廢液槽:供液槽應(yīng)含足夠的儀器緩沖液,廢液槽應(yīng)在上次使用后清洗干凈。


(3)使機器處于負亞狀態(tài),才能使細胞懸液被吸入至機器的吸管口。


(4)機器處于可應(yīng)用狀態(tài)時,指示燈會變成綠色。


2.使用中的操作


(1) 計算機部分—使用CELLQuest程序系統(tǒng)軟件:


①設(shè)定所要檢測細胞的數(shù)量:一般設(shè)10 000~20 000個細胞。


②命名本次實驗:一般含使用者的姓名和實驗日期。


③打開記數(shù)部分:顯示進入的細胞數(shù)以及檢測一定量的細胞所需要的時間。


④將微機與主機連接:控制檢測時的預(yù)檢測和實際檢測。


⑤主機設(shè)定:一般是已設(shè)定好的適合測定淋巴細胞的條件,包括探測器的電壓。探測器的電壓是調(diào)空光電倍增管所能檢測熒光密度的范圍。


⑥選擇檢測的波長和表達方式(plot):如果用一種熒光抗體,一般選直方圖(histogram);如果用兩種熒光抗體,常選點狀二維圖(dot plot)或輪廓線圖(contour plot)表


 CD69分子表達檢測直方圖的數(shù)值說明
 


 

b.abti-CD3(2 ng/ml)檢測結(jié)果
 


 

c.abti-CD3(10 ng/ml)檢測結(jié)果
 


 

CD4及CD8細胞點狀二維圖結(jié)果
 


 

不同的熒光物要求選擇不同的激發(fā)波長,參見下表
 


 

(2)細胞的吸入:將裝有細胞的FACS測定管放置到機器吸管孔處。

先預(yù)檢測樣品,然后進行實際檢測??筛鶕?jù)細胞的濃度選擇測定的速度(低、中或高)。所有的數(shù)據(jù)將自動存入微機。


3.使用后的清洗  所有樣品測定完后,要進行儀器的清洗。


(1)將裝FACS清潔液的FACS管放置機器吸管孔,高速吸入1分鐘。


(2)將裝FACS洗凈液的FACS管放置機器吸管孔,高速吸入 1分鐘。


(3)再將裝FACS清潔液的FACS管放置機器吸管孔,高速吸入5分鐘。


(4)同樣再將裝FACS洗凈液的FACS管放置機器吸管孔,高速吸入5分鐘。


(5)后將一裝有雙蒸水的FACS管放置機器吸管孔后,關(guān)閉機器。


(6)將廢液槽中的廢液倒掉,并清洗干凈廢液槽。

收起 
注意事項

1.  減少非特異熒光染色

(1)細胞的活性和狀態(tài):流式細胞儀不但可探測細胞表面的熒光,也可探測細胞內(nèi)的熒光。因此,如果要檢測細胞表面的分子,一定要保證細胞的活性,還應(yīng)盡可能保持細胞靜止,通常在4度進行操作。否則,熒光抗體進入死細胞內(nèi),會產(chǎn)生非特異結(jié)果。


(2)封閉抗體的應(yīng)用是*的,因為大多數(shù)的免疫細胞表面都表達有Fc-R。細胞與抗體相互作用后,一定要用FACS緩沖液洗2~3次,以除去游離的抗體。


2.  單染色時以FACS常用,F(xiàn)ITC標(biāo)記抗體熒光比較穩(wěn)定而且價格合適。


3.  如果同時要檢測兩種以上的分子,一定要選擇不同波長的熒光所標(biāo)記的抗體。

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