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一、 人外周血染色體制備

1. 實驗原理　

人的外周血淋巴細胞培養(yǎng)方法是1960年由Moorhead提出來的。正常情況下，人外周血小淋巴細胞都處在G1期（或G0期），但在體外給予一定的條件，進行培養(yǎng)，經72 h就可獲得大量的有絲分裂細胞。這種取材簡易、用血量少的培養(yǎng)方法已被廣泛采用。

在培養(yǎng)液中加入植物血凝素（PHA），淋巴細胞受到刺激可轉化為淋巴母細胞，進入有絲分裂。短期培養(yǎng)后，經秋水仙素處理，可抑制細胞分裂時紡錘絲的形成，使細胞分裂停止在中期，同時它可改變細胞質的黏度，引起染色體在細胞質中分散。經低滲和固定，即可得到大量的、分散效果好的染色體分裂象。人體的1ml外周血中一般含有約（1～3）×10⁶個小淋巴細胞，足夠染色體標本制備和分析之用。本節(jié)介紹人外周血淋巴細胞的懸浮培養(yǎng)法，以及染色體標本的制備。

2. 試劑與器材

（1）2ml注射器、培養(yǎng)瓶、刻度吸管，需15磅滅菌20min。離心管、吸管、量筒、載玻片，經洗液按常規(guī)清洗、烘干備用。

（2）超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，天平，離心機、顯微鏡等。

（3）試劑：

① 培養(yǎng)基的配制：

RPMI 1640培養(yǎng)基     4ml

小牛血清            1ml

青霉素和鏈霉素      各100IU/ml

PHA                 0.2ml

肝素                1小滴

以5% NaHCO3調pH至7.2～7.4, 4℃?zhèn)溆谩?/span>

② 肝素：稱取0.2g溶于100ml雙蒸水中，濃度為0.2%，滅菌。

③ 秋水仙素：生理鹽水配制成20μg/ml濃度，滅菌，分裝，置－20℃。

④ 低滲液：0.075mol/L KCl。

⑤ 固定液： 甲醇∶冰乙酸（3∶1），臨時配制。

⑥ Giemsa工作液：1份原液和９份磷酸緩沖液，臨時配制。

⑦ 磷酸緩沖液：1/15mol/L Na2HPO4、1/15mol/L KH2PO4等體積混合。

⑧ 5% NaHCO3滅菌濾器抽濾備用。

3. 實驗步驟

（1）接種，培養(yǎng)。

① 在無菌條件下，用滅菌注射器吸取0.2%肝素液（生理鹽水配制，滅菌）0.2ml，濕潤針筒后，采靜脈血1～2ml、轉動注射器使血液與肝素充分混勻。

② 無菌條件下，將肝素化血液滴入至外周血培養(yǎng)基內，每5ml培養(yǎng)液內滴入血滴28～30滴（7號針頭）輕輕混勻。

③ 置37℃恒溫箱內，靜止培養(yǎng)68～72h。注意第二天觀察培養(yǎng)液有無凝血、溶血或長菌的現(xiàn)象，可每天將培養(yǎng)液搖一搖以便細胞得到充分培養(yǎng)。

④ 終止培養(yǎng)前2～3h，加入濃度為20μg/ml的秋水仙素，每5ml培養(yǎng)基中用7號針頭，加3～4滴使zui終濃度為0.1μg/ml。輕輕搖勻后，再放入恒溫箱內，繼續(xù)培養(yǎng)2～3h，以積累較多停止在中期的分裂象。

（2）制片。

① 收獲細胞：由恒溫箱取出培養(yǎng)瓶，用吸管充分吹打培養(yǎng)瓶瓶壁，使細胞全部脫離瓶壁，然后將細胞液移至錐形離心管內，1500轉/min，離心10min，去上清液。

② 低滲處理：加入37℃預溫的0.075mol/L KCl 8ml，反復吹打（約一百次）后，置37℃水浴箱中低滲處理25min左右。

③ 預固定：加入新鮮制備固定液1ml（甲醇∶冰醋酸=3∶1），輕輕混勻。

④ 離心：2000轉/min，離心10min，吸棄上清液。

⑤ 固定：沿離心管壁慢慢加入固定液8ml，輕輕混勻，固定10min。

⑥ 離心：同上，吸去上清液。

⑦ 再固定：加固定液8ml，混勻，固定10min。

⑧ 離心：同上，吸去上清液。

⑨ 制細胞懸液：根據(jù)細胞量多少，加入適量固定液，充分混勻，制成細胞懸液。

⑩ 滴片：取出預先經冰水浸泡的載玻片，用吸管吸取混勻的細胞懸液在離冰片約30cm距離進行滴片，每片約滴2～3滴細胞懸液，使細胞較好分散。一般每一培養(yǎng)瓶可制3～5張標本片。

{11} 染色：標本晾干后，即可用染液（Giemsa液原液1份，pH6.8的磷酸緩沖液9份）染色15min，自來水沖洗后（從背面沖洗）晾干。

（3）鏡檢：人類每個體細胞有46條染色體，根據(jù)染色體的長度和著絲粒位置的不同，可以分成22對常染色體和一對性染色體，男子是46，XY；女子是46，XX。

二、體外培養(yǎng)細胞的染色體標本制備

1． 體外培養(yǎng)的細胞，在倒置鏡下觀察到有較多的分裂細胞（傳代后24h，圓形發(fā)亮的細胞）時，加入秋水仙素溶液，終濃度為0.3μg/ml培養(yǎng)液；

2． 繼續(xù)培養(yǎng)3h；

3． 胰酶消化收集細胞至離心管；

4． 離心1000轉/min，離心10min，去上清；

5． Hanks液洗，離心，去上清；

6． 低滲處理：加入0.075mol/L KCl溶液8ml，置37℃恒溫水浴中30min，用吸管稍吹打（同上）；

7． 固定及制片如外周血染色體的制備。

三、注意事項

1． 秋水仙素處理時間過長，分裂細胞多，染色體短?。环粗?，則少而細長,故秋水仙素的濃度及時間要準確掌握。

2． 固定液應在使用前臨時配制。

3． 載玻片一定要潔凈，否則染色體分散不好。

4． 染色體分裂指數(shù)低：患者處于非常時期（放、化療期）；培養(yǎng)基營養(yǎng)成分不良；培養(yǎng)基pH偏低或偏高；PHA過量或不足；小牛血清質量不高；培養(yǎng)箱溫度偏低；秋水仙素處理時間過短。

5．接種的血樣愈新鮮愈好。

6. 培養(yǎng)過程中，如發(fā)現(xiàn)血樣凝集，可將培養(yǎng)瓶輕輕振蕩，使凝塊散開，繼續(xù)放回37℃恒溫箱內培養(yǎng)。

附：

Carnoy固定液：

固定液的重要特性是能迅速穿透細胞，將其固定并維持染色體結構的完整性，還要能夠增強染色體的嗜堿性，達到優(yōu)良染色效果。單純的固定液一般難以達到這些要求，因此在實驗中使用兩種混合的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而稱其為卡諾氏固定液。Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需臨時配制，長時間放置影響固定效果，固定時間15min至24h，冰箱、室溫均可。必要時可改變甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于細胞膨脹、染色體鋪展，但易導致細胞破裂、染色體散失。

低滲液（hypotonic solution）

低滲液是指滲透壓和離子強度均低于正常細胞生理條件的溶液，滲透壓低于組織液，與外周血混在一起時，水分迅速進入細胞，使其膨脹，甚至破裂，獲得分散良好的染色體分裂象。常見的低滲液：水、低滲的檸檬酸鈉或氯化鈉、甘油磷酸鉀（0.65mol/L）、氯化jia（0.075mol/L）等。低滲效果取決于低滲液的化學組成、低滲的溫度和處理時間。低滲處理是憑借反滲透作用使細胞膨脹染色體鋪展，同時可使黏附于染色體的核仁物質散開，以便能在一個平面上觀察所有染色體形態(tài)。實驗室中一般選用0.075mol/L KCl為低滲液，其優(yōu)點有：①染色體輪廓清楚，可染色性強，染色時間短。②用于顯帶染色時能充分顯示帶型特點。低滲處理為37℃，25～30min，以預實驗條件為準。

Giemsa染液

Giemsa原液配制：稱Giemsa粉末0.5g，加幾滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油總量為33ml）。56℃中保溫90～120min。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存。使用時按要求用PBS稀釋，一般稀釋10倍。