使用奧林巴斯正置熒光顯微鏡 CX33 觀察大腸桿菌，通常需先對(duì)大腸桿菌進(jìn)行熒光染色，再按規(guī)范操作顯微鏡進(jìn)行觀察，具體步驟如下：

樣品準(zhǔn)備

培養(yǎng)大腸桿菌：將大腸桿菌接種到適宜的培養(yǎng)基中，如 LB 培養(yǎng)基，在 37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，一般培養(yǎng)時(shí)間為 6-8 小時(shí)左右。

染色：根據(jù)觀察目的選擇合適的熒光染料。若觀察大腸桿菌的 DNA，可使用 DAPI 染料；若觀察特定蛋白，可使用與相應(yīng)抗體結(jié)合的熒光染料。例如用 DAPI 染色時(shí)，取少量菌液于載玻片上，滴加適量 DAPI 染液，染色 5-10 分鐘。

制片：染色結(jié)束后，蓋上蓋玻片，盡量避免產(chǎn)生氣泡。若菌液過(guò)多，可用吸水紙吸去多余液體。

顯微鏡操作

放置與檢查：將顯微鏡平穩(wěn)放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，置于身體前方略偏左位置。檢查顯微鏡各部件是否完好，目鏡、物鏡是否清潔，調(diào)焦旋鈕、載物臺(tái)移動(dòng)旋鈕等能否正常操作，光源是否能正常發(fā)光。

放置裝片：打開(kāi)載物臺(tái)的夾具，將制作好的裝片平穩(wěn)放置在載物臺(tái)上，使樣品位于通光孔的正中央，然后輕輕夾緊裝片。

選擇物鏡：先使用低倍物鏡（如 4× 或 10×）進(jìn)行初步觀察，便于快速找到樣品并確定觀察區(qū)域。

調(diào)節(jié)光源：開(kāi)啟顯微鏡電源開(kāi)關(guān)，通過(guò)亮度調(diào)節(jié)旋鈕將光源亮度調(diào)至適中，開(kāi)始時(shí)可將亮度調(diào)得稍低，再根據(jù)觀察情況調(diào)整。

調(diào)節(jié)聚光器和孔徑光闌：調(diào)節(jié)聚光器的高度，使光線集中照射在樣品上。根據(jù)樣品特性和觀察需求調(diào)整孔徑光闌大小，低倍觀察時(shí)可適當(dāng)開(kāi)大，高倍觀察時(shí)應(yīng)縮小，以獲得合適的對(duì)比度和分辨率。

粗調(diào)對(duì)焦：轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦旋鈕，使鏡筒緩慢下降，同時(shí)從側(cè)面觀察物鏡與裝片的距離，直到物鏡接近裝片但不接觸。然后通過(guò)目鏡觀察，反向轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)焦旋鈕，使鏡筒緩慢上升，直到看到模糊的圖像。

微調(diào)對(duì)焦：使用微調(diào)焦旋鈕，對(duì)圖像進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)，使圖像達(dá)到最清晰狀態(tài)。

轉(zhuǎn)換高倍物鏡：若需要更詳細(xì)地觀察細(xì)節(jié)，在低倍物鏡下將感興趣的區(qū)域調(diào)整到視野中心后，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，更換高倍物鏡（如 40× 或 100×），更換后通常只需微調(diào)焦旋鈕即可使圖像再次清晰。

熒光觀察與記錄

選擇熒光濾光片：根據(jù)所使用的熒光染料，選擇相應(yīng)的熒光濾光片。例如觀察 DAPI 染色的大腸桿菌，需選擇適合 DAPI 激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的濾光片。

觀察熒光圖像：通過(guò)目鏡觀察大腸桿菌的熒光圖像，調(diào)整光源亮度、焦距等，使熒光信號(hào)清晰可見(jiàn)。注意觀察熒光的分布、強(qiáng)度等特征。

圖像采集：如果顯微鏡配備了成像系統(tǒng)，將其與顯微鏡正確連接，并打開(kāi)相應(yīng)的成像軟件。調(diào)整成像軟件中的參數(shù)，如曝光時(shí)間、增益等，以獲得最佳的熒光圖像效果，然后點(diǎn)擊拍攝按鈕，獲取圖像并保存。