●分子實驗中常用生化試劑原理匯總● 1.溶菌酶:它是糖苷水解酶,能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵,因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小于8時,溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖:增加溶液的粘度,維持滲透壓,防止DNA受機械剪切力作用而降解。 EDTA:(1)螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子,抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用(DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基);(2)EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環(huán)境。 2.NaOH-SDS液: NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中,是穩(wěn)定的。但當pH>12或pH<3時,就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1/L,加抽提液時,該系統(tǒng)的pH就高達12.6,因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。 SDS:SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有:(1)溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。(2)解聚細胞中的核蛋白。(3)SDS能與蛋白質(zhì)結合成為R-O-SO3-…R+-蛋白質(zhì)的復合物,使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取過程中,必須把它去除干凈,防止在下一步操作中(用RNase去除RNA時)受到干擾。 3. 3mol/L NaAc(pH4.8)溶液: NaAc的水溶液呈堿性,為了調(diào)節(jié)pH至4.8,必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液,調(diào)回pH至中性,使變性的質(zhì)粒DNA能夠復性,并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol/L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷,減少相斥力而互相聚合,后者是因為鈉鹽與SDS-蛋白復合物作用后,能形成較小的鈉鹽形式復合物,使沉淀更*。 4.為什么用無水乙醇沉淀DNA?用無水乙醇沉淀DNA,這是實驗中常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶,乙醇與核酸不會起任何化學反應,對DNA很安全,因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在,當加入乙醇時,乙醇會奪去DNA周圍的水分子,使DNA失水而易于聚合。一般實驗中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合,其乙醇的終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來替代無水乙醇(因為無水乙醇的價格遠遠比95%乙醇昂貴)。但是加95%的乙醇使總體積增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA損失也增大,尤其用多次乙醇沉淀時,就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙酵,后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。
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經(jīng)營種類:進口分裝和原裝、國產(chǎn)
性狀:盒裝液體
試劑盒保存:2-8℃低溫保存。
標本:血清、細胞上清液、尿液、體液、灌洗液、腦脊髓、心房水、胸房水、組織等。
ELISA常用的方法:雙抗體夾心法、間接法、競爭法以及BAS-ELISA等。
預期應用:ELISA法定量測定血清、、細胞培養(yǎng)上清或其它相關生物液體中的含量。
●控制和消除誤差的方法:● 誤差的大小,直接關系到分析結果的精密度和準確度。減少誤差的措施有如下幾種: 1、正確選取樣品量樣品量的多少與分析結果的準確度關系很大。在常量分析中,滴定量或重量過多或過少都直接影響準確度。在比色分析中,含量與吸光度之間往往只在一定范圍內(nèi)呈線性關系。這就要求測定時讀數(shù)在此范圍內(nèi),以提高準確度。通過增減取樣量或改變稀釋倍數(shù)可以達到此目的。 2、增加平行測定次數(shù)減少偶然誤差測定次數(shù)越多,則平均值就越接近真實值,偶然誤差亦可抵消,所以分析結果就越可靠。一般要求每個樣品的測定次數(shù)不應少于兩次,如要更的測定,分析次數(shù)應更多些。 3、對照試驗對照試驗是檢查系統(tǒng)誤差的有效方法。在進行對照試驗時,常常用已知結果的試樣與被測試樣一起按*相同的步驟操作,或由不同單位、不同人員進行測定,后將結果進行比較。這樣可以抵消許多不明了因素引起的誤差。 4、空白試驗在進行樣品測定過程的同時,采用*相同的操作方法和試劑,惟獨不加被測定的物質(zhì),進行空白試驗。在測定值中扣除空白值,就可以抵消由于試劑中的雜質(zhì)干擾等因素造成的系統(tǒng)誤差。 5、校正儀器和標定溶液各種計量測試儀器,如實驗室電子天平、旋光儀、分光光度計,以及移液管、滴定管、容量瓶等,在的分析中必須進行校準,并在計算時采用較正值。各種標準溶液(尤其是容易變化的試劑)應按規(guī)定定期標定,以保證標準溶液的濃度和質(zhì)量。 6、嚴格遵守操作規(guī)程分析方法所規(guī)定的技術條件要嚴格遵守。經(jīng)國家或主管部門規(guī)定的分析方法,在未經(jīng)有關部門同意下,不應隨意改動。
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編輯:小檀20181019
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