本文討論的范圍包括RNA酶保護分析，northernblot，原位雜交，半定量RT-PCR和定量RT-PCR。本文不談具體protocol，是因為各種書籍和kit說明書上都有，主要說一些原則，而且大部分是失敗和成功的經驗，還有小組討論結果以及各種書里七零八落看的內容，希望對大家有用。

基因表達的定義：說到基因表達，是指RNA，還是蛋白？是指mRNA還是包括風頭正旺的非編碼RNA？mRNA還有不翻譯的RNA呢。應該說轉錄水平指的是RNA水平，而蛋白應該叫翻譯水平？我們這里就特指編碼蛋白的mRNA的量的檢測吧！ 

方法：很多很多，我們常用的也就是RT-PCR和northern。RNA沒保護分析在國外很常用，也有半定量的功能，一次性試劑盒還能以此將一個表達簇一起分析，例如NFkB的轉錄激活譜中的8個常見基因。dot blot的zui大貢獻是發(fā)展到了反向dot blot的――曾經無*髦的基因芯片，而原位雜交的放大效應和它的假陽性使它的定量（半定量，應該根本算不上定量），用它定位和用蛋白定位的意義不可同日而語，又難做，只有新發(fā)現的基因可以在沒有得到蛋白和抗體的情況下進行組織或者細胞定位。

先談談RT-PCR吧。關于原位雜交和 dot blot大家可以和我論戰(zhàn)的，我曾經看到一篇公開發(fā)表的文章把dot blot稱為定量檢測，是錯誤的。

1、模板均一性問題：愚見采用從RNA定量的方法似不妥，不要說PCR的本身的敏感度，即便是在反轉錄就有差異，到了cDNA的分裝和用于模板的取樣，這些都不能保證準確，當然在反轉錄階段我們也經?？刂圃?或5ug，但這是為了再將來加樣的時候保證大致差不多，而且盡可能地利用反轉錄酶，而且RNA定量本身即使用電泳也不是那么準，更不要說分光光度計，這里說一下，我曾經看到有人說用分光光度計定量，這也不是很準確，分光光度計只是掌握大概，當然用于反轉錄足夠了，但是用于rt－pcr的定量這是不正確的，很不準的，RNA也至少要用電泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度計比較不同標本之間就更不準了。 

2、RNA制備：一般制備總RNA 即可，有時需要制備mRNA，個人認為初學者還是選擇Trizol，大量制備采用傳統(tǒng)的方法自己配，實際上和trozol一樣的，有時效果還好，trizaol也就是混一混，但是優(yōu)點在于質量保證，使用方便，效率高，根據不同組織用trizol一般可以提到全部RNA的50%（別小看，這已經很高了）以上，有些可以到達80%。mRNA用Qiagen的柱子，別去自己做Oligo（dT）柱，太麻煩。是否用DNAseI根據基因的特點和引物的設計，能夠跨內含子的就不需要處理，處理還是很危險的哦。像這樣的微量和也用不了多少次的實驗，并且如果牽涉到樣品是*的時候，因該選好的進口試劑。談到RNA的貯存實際上主要是溫度，至于放在TRIZOL中是不可取的，更不要說在胍里了，只－20是不夠的，至少－80，液氮zui保險，想想，在低溫里，即使加上些RNA酶它也降解不了哇！qiagen出了一種easy產品可用于保存標本，但在常溫也只是1天，所以低溫才是首要的，抽的時候也是這樣。 

3、反轉錄：常規(guī)，取樣盡量一致，如上所述，不是為了定量，是為了半定量PCR時圖形的好看。選擇逆轉錄酶根據實驗需要，少量的可用 Promega的一種1ug的酶，多的我們用invitrgen的5ug的II，當然有人說Promega和Roche的也不錯，用過，的確可以，要不 Invitrogen不像當初Gibco時那么牛了，也降價打折了。反轉錄成功后就不必太小心了，放在那里都可以，想想你還曾經72度滅活呢，是不是？要知道，雜合雙鏈比DNA雙鏈還穩(wěn)定的。一般來說要擴增從反轉錄到PCR全過程的長達2kb以上的片斷是相當困難的事，很多長基因是通過隨機引物庫得到的而不是通過oligo （Td）得到的，不要說反轉錄,即使是PCR也是很困難的，不信可以從質粒里試試,至于反轉錄，就更是天方夜譚了，除了酶的效率等,還有RNA的二級結構等因素，這就要一些大公司的特殊的名貴的效果也未必好的酶了，Ｒoche和Invitrogen都有的.聽天由命吧。

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