短讀取的 RNA-seq 雖然可以計數(shù)已表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，但無法提供這些轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)信息。

現(xiàn)在，斯坦福大學(xué)研究人員在《自然-生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）雜志上報告稱，他們開發(fā)出了一種能保留轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)信息的新方法，他們通過環(huán)狀 cDNA 模板和長讀取測序，實(shí)現(xiàn)了對轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體（transcript isoform）的定量和分析。

在這項(xiàng)研究中，科學(xué)家舍棄了傳統(tǒng)的短讀取 RNA 測序法，利用 PacBio 公司提供的長讀取技術(shù)來測序完整的轉(zhuǎn)錄本。他們在 20 個人體組織的混合樣本中，鑒定得到了 476,000 個轉(zhuǎn)錄本序列，平均長度 1 kb。

絕大多數(shù)哺乳動物的基因，不符合一基因一轉(zhuǎn)錄本的模式。這些基因往往存在多種剪切形式，擁有可變的轉(zhuǎn)錄起始/終止位點(diǎn)。短讀取的測序技術(shù)不能提供上述信息，舉例來說，短讀取可以檢測到發(fā)生選擇性剪切的外顯子，但無法判斷外顯子之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系，是包含在同一個轉(zhuǎn)錄本中還是各自獨(dú)立出現(xiàn)。

理論上，長讀取測序技術(shù)可以克服這樣的限制。研究人員構(gòu)建了由環(huán)狀cDNA模板組成的SMRTbell文庫，并將其用于測序。由于測序平臺的讀取長度實(shí)際上比這些 cDNA 長，該系統(tǒng)可以對每個堿基讀取多次，沿著圓環(huán)不斷進(jìn)行，生成更為的“環(huán)化一致序列”（circular-consensus sequence CCS）。在這項(xiàng)研究中，平均讀取長度達(dá)到 7 kb，絕大多數(shù) cDNA 堿基被測序了 5-15 次。

研究人員鑒定得到的絕大多數(shù)是全長轉(zhuǎn)錄本，但也并不*。這是由于 PacBio 測序讀長和 cDNA 合成效率的限制，而這兩個因素都受序列長度的影響。

論文的主要作者 Michael Snyder 表示：““對 1.5 kb 以下的 cDNA 來說沒什么問題，對于大部分2-2.5 kb的cDNA來說，也可以鑒定到全長，”作者寫道。“更長的轉(zhuǎn)錄本需要參考，質(zhì)量較低但更長的讀取數(shù)據(jù)。”總的來說，研究人員獲得了 476,000 個CCS，代表著 476 million 堿基。

研究人員將這些轉(zhuǎn)錄本，與 GENCODE 項(xiàng)目鑒定的 mRNA 進(jìn)行比對，確定了約 14,000 個全長的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體（包括編碼和非編碼的轉(zhuǎn)錄本），其中有10%是前所未見的。Snyder 表示：“這類研究就好比是盲人摸象，而我們看到了更完整的圖像。”

這項(xiàng)研究中的方法可以用于 RNA 的結(jié)構(gòu)分析和定量。不過，西班牙科學(xué)家 Roderic Guigo （未參與該研究）認(rèn)為，單純從實(shí)用性和經(jīng)濟(jì)性考慮，這一方法主要適用于前者，因?yàn)樵谡鎸?shí)樣本中為各轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體計數(shù)是很昂貴的。

麻省理工學(xué)院的 Chris Burge 教授（未參與該研究）評價道：“該方法有望在轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體水平全面注釋基因組，揭示轉(zhuǎn)錄本的詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息。”

這項(xiàng)研究可以幫助人們解決一些轉(zhuǎn)錄本難題，例如判斷相距較遠(yuǎn)的選擇性外顯子剪切是否相互關(guān)聯(lián)。不過 Burge 也指出，許多人類轉(zhuǎn)錄本實(shí)際上超過 2 kb，這一技術(shù)還有待進(jìn)一步改進(jìn)，以處理更長序列。