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精子DNA吖啶橙（acridine orange）熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

精子DNA吖啶橙（acridine orange）熒光檢測試劑是一種旨在使用吖啶橙染料使單鏈和雙鏈DNA呈現(xiàn)不同熒光，確定精子染色質(zhì)質(zhì)量或DNA損傷的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種動物或人體精子細(xì)胞以及凍存精子細(xì)胞。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡便，性能穩(wěn)定，熒光清晰。

技術(shù)背景

在男科學(xué)（Andrology）中，精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子壽命、以及生育能力的基礎(chǔ)信息。其中精子的活力（vitality）、運(yùn)動能力（motility）、授精潛力（fertilizing potential）、膜結(jié)構(gòu)或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性（integrity）、頂體反應(yīng)（acrosomal reaction）功能的評價是精子分析的重要指標(biāo)，也是決定人工受孕或體外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要參數(shù)。精子DNA損傷或染色質(zhì)質(zhì)量是不育癥的主要因素之一。使用陽離子三環(huán)胺熒光染料吖啶橙（Acridine orange；AO）染色技術(shù)，是精子染色質(zhì)分析和授精效率評價的常用的方法?；谡＞蛹?xì)胞的染色質(zhì)完整性和DNA雙鏈特性，作為DNA染色劑之一的吖啶橙與正常非變性DNA，即雙鏈DNA嵌合（intercalate）時，呈現(xiàn)綠色熒光（激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長530nm）；而與變性DNA，即單鏈DNA結(jié)合時，呈現(xiàn)紅色熒光（激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長630nm），以此定量分析精子質(zhì)量或DNA損傷。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）                                      毫升
固著液（Reagent B）                                      毫升
染色液（Reagent C）                                      毫升
產(chǎn)品說明書                                                    1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent C）避免光照，有效保證6月
  
用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
微型臺式離心機(jī)：用于樣品操作
血細(xì)胞計數(shù)器：用于細(xì)胞計數(shù)
載玻片和蓋玻片：用于精子細(xì)胞爬片
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察染色的精子細(xì)胞
細(xì)胞流式儀：用于分析染色的精子細(xì)胞

實驗步驟

一、細(xì)胞流式儀分析

1．移取新鮮獲得的1毫升精液（30分鐘至1小時內(nèi)）到1.5毫升離心管
2．放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g 
3．小心抽去上清液
4．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
5．在血細(xì)胞計數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計數(shù)：1 × 107精子細(xì)胞/毫升
6．放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g 
7．小心抽去上清液
8．重復(fù)實驗步驟4至7一次（不包括實驗步驟5）
9．加入xx微升染色液（Reagent B），混勻顆粒群
10．室溫下孵育10分鐘，避免光照
11．放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g 
12．小心抽去上清液
13．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
14．放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g 
15．小心抽去上清液
16．重復(fù)實驗步驟13至15一次
17．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
18．即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀雙通道分析：觀察10000個細(xì)胞以上，200細(xì)胞/秒；激發(fā)波長200mW，散發(fā)波長16 mW

激發(fā)波長    488nm    488nm
匹配熒光染料    異硫氰酸熒光素（FITC）    藻紅蛋白（phycoerythrin；PE）
熒光顏色    綠色    紅色
散發(fā)波長    530    630
流式儀通道    FL1    FL3
熒光增強(qiáng)    正常精子DNA    異常精子DNA
19．細(xì)胞流式儀檢測正常精子DNA（雙鏈DNA）參考圖像如下（X軸：FL3；Y軸：FL1；R1左下角為細(xì)胞碎屑；R2為正常精子細(xì)胞；R3為異常精子細(xì)胞；R4為未成熟精子細(xì)胞）

二、熒光顯微鏡分析

1．移取新鮮獲得的1毫升精液（30分鐘至1小時內(nèi)）到1.5毫升離心管
2．放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g 
3．小心抽去上清液
4．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
5．在血細(xì)胞計數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計數(shù)：1 × 107精子細(xì)胞/毫升
6．放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g 
7．小心抽去上清液
8．重復(fù)實驗步驟4至7一次（不包括實驗步驟5）
9．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻顆粒群
10．即刻移取20微升到潔凈的載玻片一端
11．用蓋玻片或另一個載玻片推片
12．置于空氣中涼干
13．加上xx微升固著液（Reagent B），覆蓋樣品表面
14．室溫下孵育2小時
15．小心抽去固著液
16．小心加上xx微升染色液（Reagent C），覆蓋樣品表面
17．室溫下孵育5分鐘，避免光照
18．小心抽去染色液
19．小心加上xx微升清理液（Reagent A），覆蓋樣品表面
20．小心抽去清理液
21．蓋上蓋玻片
22．即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)（注意：每個視野計數(shù)200個精子）
23．分析結(jié)果（參考圖）
觀察紅色熒光：濾波器激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長630nm ――可見黃色、桔紅色至紅色熒光，表明精子
DNA損傷包括單鏈DNA

觀察綠色熒光：濾波器激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm ――可見綠色熒光，表明精子DNA正常 

注意事項

1．本產(chǎn)品為50次操作
2．操作時須戴手套
3．樣品檢測前，建議在血細(xì)胞計數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計數(shù)
4．精子細(xì)胞計數(shù)時乘上稀釋倍數(shù)104。標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計數(shù)器（Hemocytometer）的計算方法是：
1毫米方塊的細(xì)胞計數(shù)X 104（稀釋倍數(shù)）＝實際細(xì)胞數(shù)/毫升
5．染色完成后，即刻進(jìn)行檢測分析，否則由于其毒性導(dǎo)致精子DNA異常
6．如果流式細(xì)胞儀出現(xiàn)干擾，建議使用630nm散發(fā)波長，或進(jìn)行補(bǔ)償處理，建議使用誘導(dǎo)處理樣品：10單位DNase I/毫升37℃孵育10分鐘或直接70℃孵育30分鐘
7．本產(chǎn)品常用于凍存精子細(xì)胞的檢測分析
8．本產(chǎn)品可以用于精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（Sperm Chromatin Structure Assay；SCSA），分析參數(shù)如下：

    %DFI    %HDS
名詞解釋    DNA斷裂指數(shù)
DNA Fragmentation Index    DNA著色程度
High DNA Stainability
相同命名    COMP αt    HIGRN
計算方法    紅色熒光：紅色＋綠色熒光之比    高亮綠色熒光
參考值    正常人：小于15％    正常人：小于10％
    閾值：小于30％    閾值：小于15％
    高生育力：0－15％    
    中等生育力：16－27％    
    低或差生育力：27－30％    
參數(shù)意義    DNA損傷程度    精子成熟程度

9．本公司提供系列發(fā)育生物學(xué)相關(guān)檢測試劑產(chǎn)品
 
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰