酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù) (Enzyme Linked Immunospot Assay, ELISPOT) 是細(xì)胞免疫學(xué)研究中的檢測方法之一，廣泛應(yīng)用于測定分泌特異性抗體或細(xì)胞因子的單個細(xì)胞對特異性抗原免疫應(yīng)答能力的細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)。
由于是單細(xì)胞水平檢測，ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等具有更高的靈敏性。ELISPOT 技術(shù)可精確測量分泌細(xì)胞的比例，達(dá)到 1/1000000 細(xì)胞的靈敏度，比傳統(tǒng)方法高2個數(shù)量級。與基于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞內(nèi)染色法 (Intracellular Cytokine Staining, ICS) 相比較，ELISPOT 技術(shù)不僅可在分泌細(xì)胞周圍持續(xù)捕獲細(xì)胞因子。同時，在檢測細(xì)胞因子的分泌時，不需要添加分泌抑制劑處理細(xì)胞。
免疫細(xì)胞在刺激物存在的條件下被激活，其分泌的細(xì)胞因子/免疫球蛋白被 ELISPOT 板底 PVDF 膜上 (預(yù)包板) 的特異性單抗捕獲，去除細(xì)胞后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的單抗結(jié)合，其后二者再與堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素結(jié)合，加入底物顯色后，PVDF 膜上有反應(yīng)作用的細(xì)胞會留下直徑大小不等的染色斑點(diǎn)，通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析儀 (ELISPOT Reader) 對斑點(diǎn)進(jìn)行自動計數(shù)和分析 (圖1)。
基于熒光檢測 ELISPOT 的方法 (FluoroSpot)：同樣采用夾心法原理，96孔板的 PVDF 膜上同時包被多種不同因子的捕獲抗體，細(xì)胞經(jīng)過刺激培養(yǎng)后，分泌的細(xì)胞因子被板底的捕獲抗體所捕獲，再同時加入兩個檢測抗體，其中一種檢測抗體帶上 Tag 標(biāo)簽，另一種檢測抗體帶 Biotin 標(biāo)簽，最后加入 anti-tag 和 Streptavidin 標(biāo)記的熒光素進(jìn)行標(biāo)記。儀器中含有濾光片，可以精確的檢測到目標(biāo)熒光，而遮蔽掉其它顏色熒光，并且保證熒光之間可以互不干擾。生成熒光斑點(diǎn)通過 FluoroSpot 讀板儀進(jìn)行斑點(diǎn)計數(shù)和數(shù)據(jù)分析。
酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù) (Enzyme Linked Immunospot Assay, ELISPOT) 集高靈敏度、高通量、單細(xì)胞水平、多重功能性檢測等優(yōu)點(diǎn)于一身，被廣泛應(yīng)用于疫苗免疫原性的效價評估、細(xì)胞治療的效價評估、基因治療的毒性評估、傳染性疾病/自身免疫性疾病的診斷和療效評估以及腫瘤治療的療效評估、移植免疫排斥的研究以及基礎(chǔ)免疫學(xué)等的研究中。
