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免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique）又稱(chēng)熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。

一、傳統(tǒng)的免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟

1、實(shí)驗(yàn)材料
細(xì)胞樣品
試劑、試劑盒：多聚甲醛、70 % 甲醇、丙酮、PBS、Triton 、BSA、DAPI 染液、DABCO、Tris、甘油
儀器、耗材：玻片

2、實(shí)驗(yàn)步驟
細(xì)胞爬片免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：

第一天：
1. 在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用 PBS 浸洗 3 次，每次 3 min。
2. 用 4 % 的多聚甲 Quan 固定爬片 15 min， PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min。
3. 0.5 % Triton X-100( PBS  配制 ) 室溫通透 20 min（細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟）。
4. PBS  浸洗玻片 3 次，每次 3 min，吸水紙吸干 PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉 30 min。
5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4 ℃ 孵育過(guò)夜。

第二天：
6. 加熒光二抗：PBST 浸洗爬片 3 次，每次 3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中 20~37 ℃ 孵育 1 h，PBST 浸洗切片 3 次，每次 3 min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行。
7. 復(fù)染核：滴加 DAPI 避光孵育 5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5 min × 4 次洗去多余的 DAPI。
8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

二、傳統(tǒng)免疫熒光實(shí)驗(yàn)主要問(wèn)題
爬片效果欠佳
細(xì)胞和試劑用量大，成本高
染液分布不均
操作繁瑣, 費(fèi)時(shí)費(fèi)力