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再擴(kuò)增SCFvVLCDR3基因文庫添加3’限制性位點

2013-1-14  閱讀(1151)

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[方法]
1.配制4個50ul PCR反應(yīng)混合液, 包含:
● 去離子水,35.5ul
● 20×dNTP(每種5mmol/L),2.5ul
● 10×Vent聚合酶緩沖液,5.0ul
● LMB3引物 (10pmol/ul), 2.5ul
● VL—NotI引物 (10pmol/ul), 2.5ul
● scFV基因模板DNA(100ng), 1ul
● VentDNA聚合酶(2單位),1.0ul
2.在有加熱蓋的熱循環(huán)儀內(nèi),加熱反應(yīng)混合液到94℃5分鐘。
3.以94℃1分鐘、42℃1分鐘、72℃2分鐘的條件共循環(huán)30次,擴(kuò)增VL基因。
4.用Winard PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。
5.用NcoI和NotI消化PCR產(chǎn)物。

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