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所謂Real-Time PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。real-time PCR技術(shù)即實時熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物監(jiān)測定量產(chǎn)生的偏差，提高實驗的重復(fù)性。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于監(jiān)測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果。
Real-Time PCR操作流程
Real-Time PCR操作流程
- 根據(jù)已知全長基因序列及待檢基因的背景信息，設(shè)計并合成Realtime PCR引物
- RNA抽提：提供組織、細(xì)胞等來源樣本的RNA抽提服務(wù)，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA
- 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品
- 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行RealTime PCR擴(kuò)增和檢測
- 檢測結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析
- 提供實驗報告：包括詳細(xì)的實驗方法及實時熒光定量PCR實驗結(jié)果的相關(guān)圖表。
