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上海博珍儀器設(shè)備制造廠
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2012-5-16 閱讀(1927)
電泳檢驗測定：質(zhì)粒電泳普通有三條帶，作別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型
吸光值檢驗測定：認(rèn)為合適而使用分光光度計檢驗測定260nm、280nm波長吸光值，若吸光值260nm/280nm的比率介于1.7－1.9之間，解釋明白質(zhì)粒品質(zhì)較好，1.8為*，低于1.8解釋明白有氨基酸污染，大于1.8解釋明白有RNA污染。
實驗材料：包括質(zhì)粒pUC18載體的結(jié)腸桿菌菌液，克隆有稻子外源斷片的BAC的結(jié)腸桿菌菌液電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。
實驗原理：在pH 12.0 ~ 12.6堿性背景中，球菌的線性大分子量染色體DNA改變性別分開，而共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA固然改變性別但仍處于拓?fù)鋽嚁_狀況。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大多染色體DNA、大分子量的RNA和氨基酸在去污劑SDS的效用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA還是為可溶狀況。經(jīng)過離心，可去掉除掉大多細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及氨基酸，質(zhì)粒DNA尚在上清中，而后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步醇化質(zhì)粒DNA。
實驗步驟：
1.取包括pUC18質(zhì)粒的結(jié)腸桿菌菌液于LA營養(yǎng)物質(zhì)上真空干燥箱37℃過夜培育；
2.汲取1.5 ml菌液，12000 g離心2分鐘，使聚在一起菌體，倒掉菌液；汲取1.5 ml菌液，再次使聚在一起菌體，盡力將菌液倒整潔；
3.參加300 ml溶液 I振動打勻，從新懸浮細(xì)胞，震動混電熱鼓風(fēng)干燥箱勻（注意：應(yīng)*打勻沉淀或碎塊）；
4.用無菌牙簽兒挑取單菌落，接種于包括Amp抗生素的LB營養(yǎng)物質(zhì)中，37℃搖床~250 r/min過夜培育；
5.參加300 ml溶液III顛倒混勻，安放于冰上10分鐘，使雜質(zhì)充分沉淀；
6.參加300 ml溶液II，輕柔顛倒混勻，安放至清脆，普通不超過5分鐘；
7.12000 g離心10分鐘；
8.汲取800 ml上清液（注意：不要汲取到漂浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，參加2/3大小的異丙醇，室溫下安放5分鐘干燥箱；
9.質(zhì)粒、BAC的品質(zhì)檢驗測定，于-20℃保留。
10.倒盡上清，加75酒精浸洗除鹽（安放一會兒或離心3分鐘后倒去上清）；
11.12000 g 常溫離心15分鐘；
12.室溫安放或超凈臺上風(fēng)干DNA；
13.加40 ml滅菌超純水或TE溶解；
