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技術(shù)文章

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟

閱讀:8066          發(fā)布時(shí)間:2013-4-3

 

 細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

 

細(xì)胞凋亡檢測(cè)可以:

1)用于腫瘤細(xì)胞和組織在內(nèi)的不同種類病理標(biāo)本研究;

2)應(yīng)用于臨床診療,新藥研制、生物制品開發(fā)、腫瘤放化療、以及從促凋亡角度探索腫瘤的基因治療;

3)對(duì)相關(guān)疾病的早期發(fā)現(xiàn)、放化療的療效評(píng)價(jià)具有舉足輕重的地位。

實(shí)驗(yàn)方法原理

本實(shí)驗(yàn)用1μg/ml 三尖杉酯堿HT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡,同時(shí)也有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide,PI)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色,可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細(xì)胞。

 

三尖杉酯堿(HT)是我國(guó)自行研制的一種對(duì)急性粒細(xì)胞白血病,急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時(shí),即可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡,并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。

細(xì)胞膜是一選擇性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿過(guò)質(zhì)膜。當(dāng)細(xì)胞壞死時(shí),質(zhì)膜不完整,PI就進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,它可嵌入到DNARNA中,使壞死細(xì)胞著色,凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞不著色。而一些活細(xì)胞染料由于為親脂性物質(zhì),可跨膜進(jìn)入活細(xì)胞,因而可進(jìn)行活細(xì)胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱,它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合(主要結(jié)合于A-T)堿基區(qū)),顯示凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。凡是看到有凋亡小體的細(xì)胞都是凋亡細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)步驟

一、試劑準(zhǔn)備

 

1.  三尖杉酯堿(HT):300μg/ml;

 

2.  Tris-HClpH7.5):100mmol/L;

 

3.  EDTA緩沖液:5mol/L

 

4.   堿性裂解液:0.2mol/L NaOH;

 

5.        醋酸鈉:3mol/L KAcpH4.8);

注意事項(xiàng)

1.  誘導(dǎo)培養(yǎng)HL-60細(xì)胞時(shí)間要準(zhǔn)確;

 

2.  熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞時(shí),由于熒光易碎滅,觀察時(shí)要盡量快。

 

 

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