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免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展zui早的一種。主要是利用熒光標(biāo)記的抗體與待測抗原間反應(yīng)進(jìn)行抗原或者半抗原物質(zhì)定位的技術(shù)。本文總結(jié)了免疫熒光技術(shù)常見的問題及解析。

1、問：近期要做免疫熒光雙標(biāo)，不知哪位有免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)的詳細(xì)步驟及其注意事項(xiàng)?

參考見解：我正在做冰凍組織切片的免疫熒光雙染。我的經(jīng)驗(yàn)是：

（1）選取一抗時(shí)要來源于兩種不同的動物，我用的是來源于rabbit和rat的抗體，二抗則是不同熒光信號標(biāo)記的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。

（2）我的做法是兩種一抗同時(shí)孵育，然后兩種二抗同時(shí)孵育。抗體濃度、孵育時(shí)間要仔細(xì)摸索，我感覺一抗4度孵育過夜比較好，背景比較清晰。

（3）我的陽性對照用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒光標(biāo)記物對照是PBS+熒光標(biāo)記物。

（4）封閉血清與二抗來源動物一致，我用的是10%的正常donkey血清。

（5）其余步驟同一般免疫熒光單標(biāo)操作。

2、問：用免疫熒光方法做組織切片和培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的蛋白，兩者操作過程有哪些不同?

參考見解：只是固定方法不同。細(xì)胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一樣的。

3、問：本人擬做Brdu標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞免疫熒光，二抗為FITC標(biāo)記，想請教各位大俠：

（1）抗體分裝和熒光顯微鏡觀察時(shí)是否一定要在暗室中進(jìn)行?

（2）封片時(shí)是否用甘油緩沖液即可，還是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液等量混合封片?

（3）免疫酶染色中的3%過氧化氫及2N鹽酸是否還需要用?

參考見解：

（1）你的二抗是用FITC標(biāo)記的，為避免熒光分解，分裝及熒光顯微鏡觀察時(shí)均要避光;

（2）封片用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液，后者能使玻片透明;

（3）關(guān)于免疫酶染色，如果是用過氧化物酶做標(biāo)記，就必須用3%H2O2以去除內(nèi)源性過氧化物酶;2N鹽酸需要使用，目的是使DNA變性，讓Brdu抗體能夠充分地與已經(jīng)摻入的Brdu結(jié)合。

4、問：做間接法免疫熒光染色，如何設(shè)置對照?

參考見解：是同一視野在未用熒光激發(fā)下進(jìn)行對照，看是否非特異性染色。

（1）空白對照：如果你做的是石蠟切片免疫組化，這個(gè)對照必須有，目的是看自發(fā)熒光，脫蠟后直接在熒光顯微鏡下觀察。

（2）陰性對照：標(biāo)本直接滴加二抗，呈陰性反應(yīng)。

（3）抗原對照：標(biāo)本加同種動物的未免疫血清，以PBS沖洗后，在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動物的血清中無特異性抗體，應(yīng)呈陰性反應(yīng)。

5、問：我做乳腺組織的免疫熒光染色，結(jié)果用激光共聚焦顯微鏡看很好：有陽性信號，陰性對照組也沒有熒光，但是拿到熒光顯微鏡下看，我的陰性對照組一片綠，像非特異性染色，到底哪個(gè)結(jié)果才是真實(shí)的呢?

參考見解：激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多，出現(xiàn)上述現(xiàn)象首先要排除熒光顯微鏡的問題，如是不是紫外燈泡壽命到期了或者別的原因，熒光顯微鏡沒有問題，那就以共聚焦顯微鏡的結(jié)果為主。

免疫標(biāo)記法可分為以下幾類：熒光免疫法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、偶聯(lián)生物素—親和素系統(tǒng)的酶免法、時(shí)間分辨熒光免疫分析、解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治?。免疫熒光?shí)驗(yàn)的主要步驟包括細(xì)胞涂片的制備、細(xì)胞的固定及通透（或稱為透化）、細(xì)胞封閉、一抗和二抗抗體孵育及熒光檢測等。