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                           細(xì)胞組織蛋白提取方法

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For Research Use Only

一、 試劑盒說明

SDS 裂解液(SDS Lysis Buffer)是一種比較強(qiáng)烈的細(xì)胞組織裂解液。SDS 裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的

Western、ChIP(染色質(zhì)免疫共沉淀)等。SDS 裂解液的主要成分為 50mM Tris(pH8.1)，1% SDS 以及多種蛋白酶及磷酸 酶抑制劑?？梢杂行б种频鞍捉到狻?/span>

用 SDS 裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用 BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。由于含有較高濃度的去垢劑等 干擾物質(zhì)，不建議使用 Bradford 法測(cè)定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。

應(yīng)用方面：可以用于 PAGE，Western，免疫沉淀（immunol precipitation，IP）等。

二、 試劑盒組份

三、操作步驟

Ⅰ 實(shí)體組織蛋白的提取

1． 在每 mL 冷 SDS 裂解液加入 10μL 100mM PMSF，混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。

2．  每 100mg 固體組織置于培養(yǎng)皿中，手術(shù)剪剪碎成 3mm×3mm 左右的小塊，加入 0.5～1 mL 冷 SDS 裂解液（如 裂解不充分可適當(dāng)添加較多的裂解液；如需要高濃度的蛋白樣品，可適當(dāng)減少裂解液用量），玻璃勻漿器上下手 動(dòng)勻漿 15 次，直至充分裂解，注意低溫操作；

3． 充分裂解后，將組織勻漿液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管，  10000 轉(zhuǎn)/分，4℃離心 5 min；

4．  取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，蛋白定量（BCA 法）；

5． 分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融，即可進(jìn)行后續(xù)的 Western、ChIP 等操作。

Ⅱ    培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取

1．在每 mL 冷 SDS 裂解液加入 10μL 100mM PMSF，混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。

2．收集細(xì)胞，加入裂解液。

2.1 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基后，加入 10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS 洗兩次，每次振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng) 液；加入上述適量配制好的 SDS 裂解液（加量參見下表），用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。

2.2 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞（或用細(xì)胞刮子刮下的貼壁細(xì)胞），將細(xì)胞及培養(yǎng)液移至離心管中， 1000 轉(zhuǎn)/分離心 10 min， 再用 10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS，1000 轉(zhuǎn)/分離心 5 min 洗兩次； 細(xì)胞洗滌后，轉(zhuǎn)至新的預(yù)冷的離心管中， 加入上述適量配制好的 SDS 裂解液（加量參見下表），置于 4℃搖床平臺(tái)上，溫和振蕩 15 min；

3． 充分裂解后（充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀）， 組織勻漿液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管， 10000 轉(zhuǎn)/分，4℃離心

5 min；

4． 取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，蛋白定量（BCA 法）；

5．  分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融，即可進(jìn)行后續(xù)的 PAGE、Western、ChIP 等操作。

RIPA 裂解液(弱)加量參考

四、注意事項(xiàng)

?      需自備 PMSF。

?      所有接觸樣品的用具及試劑均需預(yù)冷。裂解蛋白的所有步驟都需在冰浴或 4℃進(jìn)行

?      提取蛋白后，如有必要，可透析除去表面活性劑。

?      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。