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細(xì)菌和真菌的DNA如何提取呢？
閱讀：1047 發(fā)布時(shí)間：2023-6-30操作步驟：
1. 準(zhǔn)備：無(wú)水乙醇、異丙醇、PBS 及 1.5mL 離心管。
2. 取出洗滌液，按終濃度 70%比例加入無(wú)水乙醇，如7.8mL 加入18.2mL 無(wú)水乙醇，充分混勻。
3. 菌體處理：將收集的細(xì)菌或真菌 5,000 rpm 離心3分鐘，棄上清，加入 200μLPBS，振蕩混勻，5,000 rpm 離心3分鐘，充分棄上清。
4. 加入100 μL 裂解液Ⅰ，強(qiáng)烈 Vortex，直到沉淀至懸浮，無(wú)明顯塊狀沉淀，再加入裂解酶 10μL，充分混勻，室溫放置 20 分鐘。
5. 加入200 μL 裂解液Ⅱ，20μL 復(fù)合消化液，充分混勻，65℃孵育 20 分鐘。
6. 加入450μL 異丙醇，輕輕顛倒混勻，如有半透明懸浮物，不影響 DNA 的提取與后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
7. 將吸附柱放入收集管內(nèi)，將上述溶液全部轉(zhuǎn)入吸附柱內(nèi)，12,000 rpm 離心1分鐘，棄收集管內(nèi)廢液。
8. 將吸附柱放回收集管內(nèi)，加500μL 洗滌液至吸附柱內(nèi)，靜置 2 分鐘，12,000 rpm 離心 1 分鐘，棄收集管內(nèi)廢液。
9. 將吸附柱放回收集管內(nèi)，加500μL 洗滌液至吸附柱內(nèi)，12,000 rpm 離心 1 分鐘，棄收集管內(nèi)廢液。同時(shí)，按每份樣本 40μL 取洗脫液（如 10 份提取樣本，即取 400μL 洗脫液），放置于滅菌 1.5mL 離心管，65℃預(yù)熱。
10. 將吸附柱放回收集管內(nèi)，12,000rpm 離心 2 分鐘，離去殘留的洗滌液。
11. 取出吸附柱，放入新的 1.5mL離心管內(nèi)，加入上述預(yù)熱的40μL 洗脫液，靜置 2 分鐘，12,000rpm離心 2 分鐘，收集 DNA 溶液。提取的 DNA 即可用于下一步實(shí)驗(yàn)或-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
1. 裂解液、洗滌液含有刺激性化學(xué)物質(zhì)，操作過(guò)程請(qǐng)做好防護(hù)措施，避免直接接觸皮膚，防止吸入口鼻。如不慎沾染皮膚或眼睛，請(qǐng)立即用清水或生理鹽水沖洗，必要時(shí)請(qǐng)就醫(yī)。
2. 洗滌液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，按需計(jì)算用量后配制。加入乙醇后的洗滌液如使用不完，2-8℃密封保存不超過(guò) 1 周。
3. 細(xì)菌量建議不高于 10^7 。
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