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PCR擴(kuò)增反應(yīng)的步驟和影響因素分析
閱讀：5835 發(fā)布時間：2020-7-13
PCR(Polymerase Chain Reaction)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)。通過變性、退火、延伸等步驟,體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。
防止污染的首要原則是要設(shè)置NTC(No Template Contro|)對照，一個不含有模板DNA但含有PCR體系中所有其他成分的對照。如果不能在污染的第一時間發(fā)現(xiàn)，會導(dǎo)致后續(xù)一系列的數(shù)據(jù)無法使用。準(zhǔn)備PCR體系的移液器要，千萬不能用吸取過PCR產(chǎn)物的移液器去準(zhǔn)備PCR體系。
經(jīng)典的PCR擴(kuò)增反應(yīng)分為三步：
1、高溫變性：模板DNA經(jīng)加熱至95℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；
2、低溫退火：模板DNA與引物的復(fù)性，模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；
3、適溫延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶的作用下，以核苷酸為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
影響擴(kuò)增的因素：
1、由于各種原因，造成的PCR擴(kuò)增體系中出現(xiàn)了非目的檢測樣本本身的模板，使得PCR結(jié)果出現(xiàn)假陽性
2、操作錯誤或者誤差造成的模板間交叉污染
3、PCR試劑的污染
4、PCR實(shí)驗(yàn)器材的污染
5、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠污染
防止污染的首要原則是要設(shè)置NTC(No Template Contro|)對照，一個不含有模板DNA但含有PCR體系中所有其他成分的對照。如果不能在污染的第一時間發(fā)現(xiàn)，會導(dǎo)致后續(xù)一系列的數(shù)據(jù)無法使用。準(zhǔn)備PCR體系的移液器要，千萬不能用吸取過PCR產(chǎn)物的移液器去準(zhǔn)備PCR體系。