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激光捕獲顯微切割顯微鏡的技術(shù)步驟

閱讀:213      發(fā)布時(shí)間:2025-6-16
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激光捕獲顯微切割顯微鏡(LaserCaptureMicrodissection,LCM)是一種用于從組織切片中精準(zhǔn)地分離和收集特定細(xì)胞或組織區(qū)域的技術(shù)。它結(jié)合了激光技術(shù)和顯微鏡的優(yōu)勢,廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等領(lǐng)域。其主要技術(shù)步驟如下:  
1.樣本準(zhǔn)備  
組織切片制備:將待分析的組織或細(xì)胞樣本切成薄片(通常為5–10μm厚),并放置在適當(dāng)?shù)妮d玻片上。通常使用冷凍切片機(jī)或石蠟切片機(jī)進(jìn)行切割。切片后,組織可以進(jìn)行染色,以幫助區(qū)分不同的細(xì)胞類型或組織結(jié)構(gòu)。  
固定與染色:樣本需要經(jīng)過適當(dāng)?shù)墓潭ǎㄈ缡褂眉兹┗蚓凭潭ǎ┮苑乐菇M織退化,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行染色。常見的染色方法有H&E染色、免疫組織化學(xué)染色等。  
2.顯微鏡設(shè)置  
顯微鏡調(diào)節(jié):使用激光捕獲顯微切割顯微鏡的顯微鏡部分,首先調(diào)整顯微鏡的放大倍率,確保能清晰地觀察到目標(biāo)細(xì)胞或組織區(qū)域。  
激光設(shè)置:根據(jù)需要設(shè)置適當(dāng)?shù)募す夤β屎徒咕?,以確保激光能夠精準(zhǔn)地切割目標(biāo)區(qū)域。激光波長通常在紫外或紅外范圍內(nèi),可以與不同的樣本類型進(jìn)行兼容。  
3.激光捕獲與切割  
定位目標(biāo)區(qū)域:通過顯微鏡實(shí)時(shí)觀察,定位需要捕獲的目標(biāo)區(qū)域。操作人員可以通過圖像來確定目標(biāo)區(qū)域的形狀和大小,并確保其周圍區(qū)域清晰可見。  
激光切割:使用激光束直接切割目標(biāo)區(qū)域的組織。激光切割過程會將切割的組織區(qū)域加熱,形成蒸汽壓力,進(jìn)而分離該區(qū)域。激光可精確地去除目標(biāo)細(xì)胞或組織,避免損傷周圍細(xì)胞。  
4.組織捕獲  
捕獲目標(biāo)細(xì)胞或區(qū)域:在激光切割的同時(shí),通常會使用一種透明的聚合物膜(例如聚乙烯醇膜)或直接在切片上進(jìn)行激光加熱,使目標(biāo)組織與載玻片分離,并將其粘附到采集膜或目標(biāo)板上。  
收集切割區(qū)域:被切割的組織通過激光系統(tǒng)被收集到微小的塑料捕獲帽或收集杯中,通常這些容器可以包含用于進(jìn)一步分析的溶液。  
5.后處理與分子分析  
RNA/DNA/蛋白質(zhì)提取:捕獲的細(xì)胞或組織區(qū)域通常會被用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)分析,例如RNA、DNA或蛋白質(zhì)的提取。這些提取物可用于qPCR、基因組測序、RNA-seq、Westernblot等實(shí)驗(yàn)。  
數(shù)據(jù)分析:通過對提取物的進(jìn)一步分析,研究人員可以獲得關(guān)于目標(biāo)細(xì)胞群體或區(qū)域的詳細(xì)分子信息,如基因表達(dá)譜、突變分析等。  
6.數(shù)據(jù)解讀與驗(yàn)證  
分析數(shù)據(jù):通過高通量技術(shù)(如基因表達(dá)芯片、RNA-seq等),可以獲得被捕獲細(xì)胞的分子特征,進(jìn)行差異分析或功能注釋。  
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):通常會進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),如免疫熒光染色、原位雜交等,以驗(yàn)證激光切割獲取的樣本是否代表了目標(biāo)區(qū)域或細(xì)胞的特征。  
注意事項(xiàng):  
樣本質(zhì)量:為了獲得高質(zhì)量的捕獲樣本,切片時(shí)的厚度、染色質(zhì)量、組織的固定及切割方法都需要非常精確。  
激光能量控制:激光能量的過高可能會損傷周圍組織,因此在操作時(shí)需要特別注意控制激光功率。  
總結(jié)來說,激光捕獲顯微切割顯微鏡技術(shù)通過精確地定位和切割目標(biāo)細(xì)胞或組織區(qū)域,結(jié)合高效的分子分析,幫助研究人員獲取特定組織的高質(zhì)量樣本,進(jìn)行深度分析。

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