轉(zhuǎn)基因復印數(shù)熒光定量PCR辦法
挑選一種合宜的陽性標準品來畫出標準曲線，是應用實時熒光定量 PCR 技術(shù)正確認量模型板起初液體濃度的基礎。近年來，國里外的科學家做了不一樣的試驗。Song(2002)等覺得理想的標準品應當是已插進去外源基因的植物基因組DNA ，況且用Southern blot正確測得插進去的外源基因復印數(shù)。不過在實際研討中，很不容易得到到這么一套標準品。因為這個，他提出代替方案，依據(jù)外源基因復印數(shù)和野生型植物 DNA 的體積，按一定液體濃度比值混合，制成標準曲線。例如，在玉茭的外源基因復印數(shù)研討中它們發(fā)覺，在參加熒光染布材料SYBR GREEN I的20 μL PCR反響整體體系中，應以6 ng野生型玉茭基因組DNA 作為模型板量。已知玉茭基因組DNA 體積為2.5 × 10.9 bp(Armuganathan和Earle 1999)，相應于6 ng的玉茭DNA ，即可計算出摹擬1、2、4、8、16個外源基因復印時，應參加的質(zhì)粒 DNA 的量。
利用新式、銳敏、高通量的實時熒光定量PCR辦法可以用于標定原始品系中轉(zhuǎn)基因的*復印數(shù)。實時熒光定量PCR技術(shù)是一種較新的DNA 定量辦法。其定量的基本原理是在PCR反響整體體系中參加非特別優(yōu)異性的熒光染布材料(如：SYBR GREEN I)或特別優(yōu)異性的熒光探針(如：Taqman 探針)，實時檢驗測定熒光量的變動，取得不一樣樣品達到一定的熒光信號(閾值)時所需的循環(huán)回數(shù)：CT值(Cycle Threshold)；經(jīng)過將已知液體濃度標準品的CT值與其液體濃度的對數(shù)畫出標準曲線，就可以正確認量樣品的液體濃度。熒光定量 PCR 技術(shù)具備簡單方便、敏捷的長處，能夠管用擴增低復印的靶斷片DNA ，對每克樣品中20 pg-10 ng的轉(zhuǎn)基因成分施行管用檢驗測定。同時，與Southern法相形，熒光定量PCR技術(shù)可對T-DNA 的不一樣序列施行擴增，因為這個能成功實現(xiàn)對品系中的基因重組的檢驗測定干燥箱KLYQ、生化培養(yǎng)箱。
以這些個梯度混合液作為標準品，就可畫出標準曲線，檢驗測定樣品的液體濃度并計算插進去的復印數(shù)了。實驗表明，用這種辦法取得的數(shù)值和 Southern blot 的zui后結(jié)果相當*一樣。Giovanna(2002)將農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因西紅柿作為研討材料，挑選了雙元載體T-DNA 區(qū)上的兩個外源基因TSWV-N(Tomato spotted wilt virus)、nptⅡ(neomycin phosphoril-transferaseⅡ)和一個單復印的內(nèi)源基因(endogenous gene)作為熒光定量PCR擴增的模型板，檢驗測定外源基因復印數(shù)。他覺得運用植物基因組 DNA 和一定比例質(zhì)粒的混合液作為標準品，會累積很多沒有辦法防止的誤差。譬如運用這種標準品不可少預先曉得待測植物基因組 DNA 的非常準確分子量，并對植物 DNA 和質(zhì)粒正確認量，但在大部分數(shù)事情狀況下獲得的數(shù)值都只是近似商，再以資混合液作為標準品檢驗測定每一植株的外源基因復印數(shù)時，便會放大這些個誤差。
因為這個，他提出“相對CT”或“δ-δCT”的辦法，這個辦法的長處是不必為每每實驗制造標準曲線，只消一個優(yōu)化步驟證實外源基因與內(nèi)源基因有相同的，至少是相仿的反響速率即可。與其他定量技術(shù)如 Southern Blot 相形，實時定量 PCR 技術(shù)的特別優(yōu)異性和高信嗓比特別的性質(zhì)為轉(zhuǎn)基因復印數(shù)定量供給了一點便捷。與實時定量 PCR 相形，DNA 點雜交技術(shù)要消耗的錢價不低的試藥、勞力以趁早間。每個條帶至少需求2微克的 DNA 用于放射性檢驗測定或是至少 10 微克用于熒光檢驗測定，因為這個，需求數(shù)量多的團體樣品，實驗務必等到每個植株通過傳代能夠供給足夠數(shù)目的團體后才可以用于檢驗測定復印數(shù)。電熱恒溫鼓風干燥箱、干燥箱KLYQ、培養(yǎng)箱KLYQ。
假如存在重組的話，zui后結(jié)果將更為復雜。定量PCR剖析的轉(zhuǎn)基因復印數(shù)稍高于Southern Blot的剖析zui后結(jié)果，主要端由是Southern Blot辦法在同一個插進去位點有多復印的T-DNA 斷片插合乎時尚，轉(zhuǎn)基因植株的在酶切特殊情況萌生相仿的DNA 斷片，電泳剖析時很難分清。定量PCR辦法則防止了這種事情狀況的發(fā)生，錯非目標基因DNA 斷片在PCR引物處發(fā)生斷開。兩種辦法剖析zui后結(jié)果的比較顯露定量PCR辦法剖析復印數(shù)更加管用、適合使用。
