我們?nèi)粘ＩV分析工作中，反相色譜柱的使用頻次是相對較高的，下面總結(jié)一下反相色譜柱的使用注意事項(xiàng)，為廣大色譜分析工作者作參考。

反相柱的安裝與活化

新開啟的反相色譜柱，出廠保存溶劑一般是甲醇或85%甲醇。我們拿過來先不要著急使用到具體的方法上。

1，將色譜柱入口端連到液相上，用甲醇或乙腈沖柱，出口端用廢液缸接著，看出口端是否有氣泡流出（避免氣泡進(jìn)入檢測系統(tǒng)），若有氣泡，則用甲醇或乙腈沖干凈氣泡，然后再連接到檢測器入口端。

2，如果實(shí)驗(yàn)所需流動(dòng)相不含有鹽，直接切換初始梯度比例的流動(dòng)相平衡色譜柱即可；如果流動(dòng)相含有鹽，先用高比例水相（如水/乙腈=90：10）過渡，然后再切換至含有鹽的流動(dòng)相初始梯度比例平衡色譜柱。

3，色譜柱平衡過程，先是柱壓逐漸平穩(wěn)，然后基線走平，最后看平衡柱體積在10個(gè)柱體積以上。就可以運(yùn)行方法，進(jìn)樣檢測了。

反相流動(dòng)相及樣品的制備

1，有機(jī)溶劑須使用HPLC級別以上的，水盡可能使用超純水；,

2，添加鹽的流動(dòng)相，須經(jīng)過孔徑≤0.45μm的濾膜過濾（濾膜確保與流動(dòng)相兼容，不會(huì)被溶解）；

3，當(dāng)緩沖鹽濃度較高時(shí)（50mM以上），可以在有機(jī)相中添加一定比例的水（如乙腈/水-80：20），避免梯度最后有機(jī)相比例過高，造成鹽析。

4，避免單一相長時(shí)間使用一瓶100%水相流動(dòng)相，水相容易滋生細(xì)菌（尤其含有緩沖鹽時(shí)），水相一般1-3天更換（更換頻次視室溫而定）。有時(shí)需要配置大量水相長時(shí)間使用時(shí)，可以添加3-5%的有機(jī)相，來有效抑制長菌。

5，流動(dòng)相避免敞口放置，會(huì)落入灰塵、細(xì)菌，且含有有機(jī)相時(shí)會(huì)部分揮發(fā)，造成比例變化，不能重現(xiàn)，還會(huì)影響人員的身體健康。

6，待測樣品的制備：

①我們精確稱量樣品后，盡量用初始梯度比例的流動(dòng)相去溶解到我們需要的濃度；

②如果溶解性差，可以加一些助溶試劑（如DMF）；

③進(jìn)樣前過一下≤0.45μm的濾膜，如果樣品比較復(fù)雜，含有過多基質(zhì)，可離心再過濾。

反相色譜柱的保存

1，長時(shí)間不用（一周以上），盡量保存在高比例有機(jī)相中。,

2，保存前的沖洗：多數(shù)方法里會(huì)用到緩沖鹽，一般先用高比例水相將緩沖鹽沖洗干凈，再置換成高比例有機(jī)相保存，同時(shí)也將強(qiáng)保留的小極性污染物沖干凈。