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CRISPR-Cas9的改良技術(shù)

                                -- 細(xì)胞特異性敲除與miNRA-Cas9開關(guān)

    近日，日本實驗室發(fā)表了有關(guān)miRNA-Cas9開關(guān)與細(xì)胞特異性敲除的報告，他們將Trilink的修飾NTPs 結(jié)合到定制的Cas9 mRNA中，用于優(yōu)化CRISPR Cas9 基因編輯在細(xì)胞特異性中的應(yīng)用。

    目前，以DNA為基礎(chǔ)的基因編輯發(fā)展迅速，尤其是CAR-T療法（Novartis’ Kymriah 和 Gilead’s Yescarta）。但在某些應(yīng)用程序中，成功的限制性因素在于其以細(xì)胞類型*的方式運(yùn)作的能力。研究小組選擇了一種基于RNA的傳遞系統(tǒng)，以克服一些以DNA為基礎(chǔ)的系統(tǒng)相關(guān)的安全問題，包括基因組整合系統(tǒng)的安全問題等。

    研究報道：為了調(diào)控Cas9的核酸內(nèi)切酶活性，已有幾種方法，包括光或小分子蛋白誘導(dǎo)系統(tǒng)、組織特異性啟動子系統(tǒng)，和采用split-cas9的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)電路。但這些報導(dǎo)主要都是使用DNA傳遞方法。

    該研究團(tuán)隊設(shè)計了一個基于mRNA的Cas9開關(guān)，該開關(guān)是由具細(xì)胞特異性的microRNA（miRNA）調(diào)控。具體來說，他們引進(jìn)了miRNA的互補(bǔ)序列到Cas9 mRNA的5'端非編碼區(qū)（見圖1），假設(shè)通過檢測異質(zhì)性細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性miRNA水平，可以選擇性地控制基因組編輯。當(dāng)靶基因miRNA缺乏時，Cas9蛋白被翻譯表達(dá)，當(dāng)靶基因miRNA存在時，該蛋白翻譯表達(dá)被抑制。

      研究報告顯示，他們miRNA-cas9開關(guān)有效地和選擇性地響應(yīng)了HeLa細(xì)胞中的miRNA。同時，使用不同的標(biāo)記mRNA，在人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）中都可看到類似的結(jié)果。      

    另外，使得驚喜的是，此系統(tǒng)也能夠區(qū)分誘導(dǎo)和分化的神經(jīng)元細(xì)胞胞，此功能可能將在臨床應(yīng)用中起重要作用。

    同時，為進(jìn)一步優(yōu)化相關(guān)領(lǐng)域，他們提出，可通過含有多個miRNA開關(guān)的Cas9系統(tǒng)實現(xiàn)，例如減少泄漏表達(dá)等。

     研究小組得出結(jié)論：系統(tǒng)應(yīng)適用于其他Cas9變異（例如同源基因工程蛋白Cas9 / dCas9）和其他miRNA的即插即用方式。”這個功能和易用性可以很好地改良CRISPR-Cas9技術(shù)。

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