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當(dāng)前位置：上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司>>技術(shù)文章>>上海旦鼎講解基因擴(kuò)增PCR的擴(kuò)增與克隆方法
基因擴(kuò)增PCR主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平等。加樣器、天平除了要外，還應(yīng)有定期校準(zhǔn)。試劑分裝應(yīng)在超凈臺中進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)混合液應(yīng)使用分子生物學(xué)級的，試劑制備好后應(yīng)有質(zhì)檢：一是否有污染、二是檢測試劑的擴(kuò)增效果。
基因擴(kuò)增PCR的擴(kuò)增與克隆方法：
?、僖锏男蛄袘?yīng)位于基因組DNA的高度保守區(qū)，且與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異性結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性
?、谝镩L度：15－40bp為宜。引物過短或過長均可使反應(yīng)的特異性下降。
③引物的堿基盡可能隨機(jī)發(fā)布，避免出現(xiàn)數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，G+C堿基的含量在40%－75%之間。
④引物內(nèi)部應(yīng)避免形成二級結(jié)構(gòu)，特別是引物的末端應(yīng)避免有回文結(jié)構(gòu)。
?、荻€(gè)引物不應(yīng)有互補(bǔ)序列，特別是3’端應(yīng)避免互補(bǔ)，以免形成“引物二聚體”，浪費(fèi)引物。
?、抟?’末端堿基無嚴(yán)格限制，在與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠的條件下，其5’端堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)，因此可在引物5’端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、啟動子序列或其它序列等以便于PCR產(chǎn)物的分析克隆等，引物的5’端至多可加10個(gè)堿基而對PCR反應(yīng)無影響。
基因擴(kuò)增PCR的使用建議：
1、使用本制品時(shí)務(wù)必將Buffer反復(fù)混勻后再加，避免因組分不一導(dǎo)致結(jié)果差異；
2、配置和分裝反應(yīng)液時(shí)請一定使用新的（無污染的）噴頭以避免污染；
3、如擴(kuò)增條帶多，可適當(dāng)添加酶和dNTPs；
4、當(dāng)多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度均在1kb以內(nèi)時(shí)，使用3%～4％濃度的Agarosegel進(jìn)行電泳分離效果。
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