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蛋白質(zhì)檢測(cè)－Western Blot
點(diǎn)擊次數(shù)：1813 發(fā)布時(shí)間：2012-1-9
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。
1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來(lái)回滾動(dòng)去除所有的氣泡。
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤(rùn)和沒(méi)有氣泡。
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒(méi)凝膠。
5）按照所示接通電源開(kāi)始電泳轉(zhuǎn)移。
6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。
3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液。
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí)。
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
8．混合：NGS（100微升），印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)（或4℃過(guò)夜）
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。
10． 將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。
11． 按步驟9洗滌。
12． 加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。
13． 按步驟9洗滌。
14． 配制顯色指示劑/底物：混合顯色指示劑原液3.0ml，PBS 9.0ml，加入1%過(guò)氧化氫150.0微升。立即使用。
15． 于室溫下?lián)u動(dòng)直至出現(xiàn)紫色并開(kāi)始看到背景（1~10分鐘）。
16． 將薄膜轉(zhuǎn)到另一盛水容器中洗滌，終止顯色反應(yīng)，空氣干燥，封入塑料袋中避光保存。