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實時熒光定量PCR儀使用注意事項

閱讀:2228      發(fā)布時間:2022-6-20
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  實時熒光定量PCR儀指的是在PCR進(jìn)行的同時,對其過程進(jìn)行監(jiān)測的能力(即實時)。因此,數(shù)據(jù)可在PCR擴增過程中,而非PCR結(jié)束之后,進(jìn)行收集。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來了革命性的變革。在實時熒光定量PCR(qPCR)中,反應(yīng)以循環(huán)中檢測到目標(biāo)擴增的時間點為特征,而非在一定循環(huán)數(shù)后目標(biāo)分子累計的擴增量。目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越高,則會越快觀察到熒光的顯著增加。相反,終點法檢測(也稱“讀板檢測”)測量的是PCR循環(huán)結(jié)束時累計的PCR產(chǎn)物量。
 
  實時熒光定量PCR儀注意事項:
  1.在實驗過程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中,注意避免mRNA斷裂。
  2.為了防止非特異性擴增,必須設(shè)陰性對照。
  3.內(nèi)參的設(shè)定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。
  4.PCR不能進(jìn)入平臺期,出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù),均應(yīng)通過單獨實驗來確定。
  5.防止DNA的污染:采用DNA酶處理RNA樣品,在可能的情況下,將PCR引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線性。
  6.所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。
  7.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用)。
  8.有機玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室溫10min,然后用0.1%DEPC水沖洗,晾干。

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