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DNA 的定?與接合反應
閱讀：684 發(fā)布時間：2010-7-5藥品試劑：
純化的gusA 片段及pQE31 BamHI/HindIII 片段
1% 6-well agarose gel
DNA 標準分子? （λMr, 0.5 μg/μL）
方法步驟：
1） 取4 支微?離心管，依下表加入DNA, TE-8.0 及追蹤染劑 （μL）：
2） 短暫離心混合后，將各管樣品置65℃水浴5~10 min 后，移至冰浴?溫后進?電泳分析。
3） 將膠體置于UV transilluminator 上觀察各色帶的??，與已知?的 λMr 比較，找出分別與#3, #4 ??相當?shù)钠巍?br />4） 估計 #3, #4 的DNA ?及計算每 μL 所含的莫耳數(shù)。
純化的gusA 片段與經(jīng)BamHI/HindIII 作用的pQE31 片段混合后，末端序?互補的部份會進?黏合，但仍須藉由DNA ligase 催化phosphodiester bond 的形成，將缺口接合起?。
儀器用具：12℃恒溫槽
藥品試劑：
純化的gusA 片段及pQE31 BamHI/HindIII 片段
T4 DNA ligase （1 U/μL, Invitrogen）
5×T4 DNA ligase buffer （0.25 M Tris-HCl, pH 7.6; 50 mM MgCl2; 5 mM ATP; 5 mM DTT; 25% PEG-8000）
方法步驟：
1） 兩種DNA 片段于65℃水浴加熱10 min 后，置冰浴中。
2） 取5 支微?離心管置冰浴中，依下表所? （單位 μL） 依序加入各成份：
* Vector 與Insert 的比?為莫耳數(shù)比，DNA 總?為100 ng。
3） #1~#4 置于12℃反應過夜，#5 則?加ligase，直接置于4℃冰箱。
4） #1~#4 反應過夜后，以70℃加熱10 min，置冰浴中。