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ELISA測定的常用模式--間接法測抗體
閱讀：1731 發(fā)布時間：2011-11-29 基本方法的操作如下:
1．將病原體的抗原在碳酸鹽緩沖液中4~C過夜包被，形成固相抗原，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。
2．加入含待測抗體的臨床樣本如血清等，溫育一定時間后洗板；此時，待測抗體就會與固陽上特異抗原反應而吸附于固相上。
3．加入酶標記的抗人IgG抗體，溫育一定時間后洗板；此時，在固相上即形成固相抗原—待測抗體—酶標二抗復合物。
4．加入酶底物，溫育顯色測定（圖2—6）。
間接法測抗體在目前應用zui多的是丙型肝炎病毒抗體（抗HCV）、人免疫缺陷病毒抗體（抗HIV）以及梅毒螺旋體抗體等的測定。從上述的測定模式可見，間接法測抗體，嚴格地講，所測定的僅為抗體的IgG類，不涉及IgM和IgA類，這是由酶標二抗體所決定的。
影響間接法測定抗體的一個較大的因素是包被抗原的純度?，F(xiàn)在間接法測抗體中所使用的抗原一般均為基因工程重組抗原，如HCV的NS3，NS4，NS5，HIV的gp41和gpl20和梅毒螺旋體TpNl5，TpNl7，TpN47等。基因工程抗原在純化時應盡量去除用來表達的宿主如大腸桿菌的抗原，以免由于機體存在對這種宿主抗原的抗體而引起假陽性反應。此外，由于機體的IgG類抗體濃度較高，其中絕大部分為機體接觸外界環(huán)境刺激所產(chǎn)生的非特異IgG，因此，為避免這些高濃度非特異IgG對固相的吸附所致的假陽性反應，通常需對待測樣本做一定程度的稀釋。